Najnowsze testy NIPT i ich zastosowanie w diagnostyce prenatalnej

Diagnostyka prenatalna przeszła długą drogę od końca lat 60. ubiegłego stulecia, kiedy możliwe stało się oznaczanie kariotypu w płynie owodniowym pobranym na drodze amniopunkcji. Warto przypomnieć, o czym mało kto pamięta, że w owych czasach amniopunkcję wykonywano bez kontroli ultrasonograficznej, jako że technologia USG nie była jeszcze wystarczająco zaawansowana. Dopiero rozwój techniczny w latach 80. XX w. przyniósł gwałtowny postęp w wykorzystaniu ultrasonografii w położnictwie. Poprawa jakości obrazu pod koniec lat 80. i na początku lat 90. pozwoliła na dalszy rozwój diagnostyki ultrasonograficznej. Od tego czasu dzięki technice ultrasonograficznej rozpoczął się niezwykły rozwój diagnostyki prenatalnej, który doprowadził do stworzenia koncepcji płodu jako pacjenta i rozwoju medycyny płodu takiej, jaką znamy dzisiaj.

Diagnostyka prenatalna w kierunku chorób o podłożu genetycznym

Badania przesiewowe

Przez wiele lat paradygmatem rozwoju badań przesiewowych w diagnostyce prenatalnej było wyodrębnienie spośród wszystkich ciężarnych kobiet tych, u których ryzyko, że urodzą chore dziecko, było istotnie wyższe niż u innych. Najczęściej punktem odniesienia jest grupa wszystkich kobiet ciężarnych w tym samym wieku. 
O tym, że starsze kobiety częściej rodzą chore dzieci, wiedziano już od drugiej połowy XIX w. W 1866 r. ukazała się publikacja, w której brytyjski lekarz John Langdon Down opisał swoje obserwacje przeprowadzone u dorosłych osób z – jak byśmy to dzisiaj powiedzieli – niepełnosprawnością intelektualną, będących pensjonariuszami ośrodka dla dorosłych, w którym pracował. Zauważył, że po pierwsze, niespokrewnione osoby będące pensjonariuszami ośrodka są do siebie podobne (dzisiaj mówimy, że mają podobne cechy fenotypowe); po drugie, łączy je to, że w większości przypadków ich matki, kiedy wydały je na świat, były już w starszym wieku, pod koniec okresu rozrodczego. W taki sposób opisano po raz pierwszy zespół, nazwany później zespołem Downa, za który odpowiada trisomia 21. pary chromosomów. 
Trisomia 21 jest najczęstszą chorobą genetyczną występującą w populacji ogólnej, inaczej zwanej grupą niskiego ryzyka, tj. u osób, które nie mają obciążonego wywiadu, czyli w rodzinie nie występują choroby genetyczne o podłożu dziedzicznym. Jest także najczęstszą przyczyną niepełnosprawności intelektualnej o podłożu genetycznym. Zwykle podaje się, że trisomia 21 występuje z częstością 1:700 żywych urodzeń. 
Należałoby się spodziewać, że w krajach, gdzie jest dobrze rozwinięta diagnostyka prenatalna i możliwa jest terminacja ciąży z przyczyn embriopatologicznych, częstość występowania trisomii 21 będzie się zmniejszać, ponieważ praktycznie we wszystkich krajach europejskich (z nielicznymi wyjątkami) ok. 95% kobiet decyduje się na terminację ciąży w przypadku prenatalnego rozpoznania zespołu Downa. Z drugiej strony systematycznie rośnie średnia wieku kobiet ciężarnych. Skoro więcej kobiet w starszym wieku decyduje się na macierzyństwo, należałoby się spodziewać większej liczby urodzeń dzieci z zespołem Downa. Jednakże dzięki diagnostyce prenatalnej ta liczba pozostaje mniej więcej stała. Należy podkreślić, że skrining prenatalny w kierunku chorób o podłożu genetycznym i następnie diagnostyka inwazyjna to nie jest search and destroy mission wymierzona w dzieci z zespołem Downa, jak to niektórzy do niedawna usiłowali przedstawiać. 
Trzeba pamiętać, że kobieta w ciąży, która zgłasza się do lekarza w sprawie badań prenatalnych, tak naprawdę nie chce wiedzieć, czy urodzi dziecko z zespołem Downa, czy nie. Ona chce wiedzieć, czy urodzi zdrowe dziecko. A tak naprawdę chce usłyszeć, że urodzi zdrowe dziecko.
Niewątpliwym ograniczeniem testu złożonego, który w ostatnich latach stał się „standardem złota”, jeżeli chodzi o badanie przesiewowe w ciąży, jest to, że umożliwia on ocenę liczbowej wartości ryzyka tylko dla trzech najczęściej występujących chorób genetycznych, tj. trisomii 21, 18 i 13. Oczywiście nie ulega wątpliwości, że test złożony ma wiele innych zalet. Dość wymienić chociażby możliwość skriningu w kierunku preeklampsji. Nie można zapomnieć o kluczowej roli badania USG między 11. a 14. tygodniem ciąży, ponieważ żaden, nawet najlepszy test genetyczny nie potwierdzi, że płód ma dwie ręce, dwie nogi i głowę.

Badania inwazyjne: amniopunkcja i biopsja kosmówki

Kolejnym szczeblem w „drabinie diagnostycznej”, po której poruszamy się w diagnostyce prenatalnej, jest wykonanie badania inwazyjnego, które umożliwia potwierdzenie lub znacznie częściej wykluczenie choroby genetycznej u dziecka pacjentki, u której to ryzyko jest zwiększone, co wykazały badania przesiewowe. Ponieważ najczęściej pacjentka trafia do gabinetu niezwykle zestresowana przed amniopunkcją, warto ją uspokoić, że badanie inwazyjne wykonujemy, by upewnić się, że dziecko będzie zdrowe. Oczywiście w zakresie, na jaki pozwala wykonane następnie badanie genetyczne, inne są możliwości „klasycznej” oceny kariotypu, a inne – mikromacierzy (array comparative genomic hybridization – aCGH), niejednokrotnie zwanej (nie bez powodu) kariotypem molekularnym.
Przez wiele lat, tj. od 2004 r., od publikacji Ann Tabor, aż do 2015 r., kiedy swoją metaanalizę opublikował Ranjit Akolekar, przyjmowano, że dodatkowe ryzyko poronienia po amniopunkcji wynosi 1%, a po biopsji kosmówki – 2% [1, 2]. Powszechnie uważano te wartości za wysokie ryzyko utraty ciąży. Zatem celem badań przesiewowych w diagnostyce prenatalnej było osiągnięcie jak największego współczynnika wykrywalności (detection rate – DR) przy jak najmniejszym odsetku wyników fałszywie dodatnich (false positive rate – FPR). FPR odpowiada odsetkowi wykonanych procedur inwazyjnych (invasive procedure rate – IPR), ponieważ aby zweryfikować dodatni wynik testu przesiewowego, trzeba wykonać test diagnostyczny. W tym przypadku jest to badanie inwazyjne (amniopunkcja lub biopsja kosmówki), które jednak wiąże się z określonym ryzykiem poronienia oraz dużym stresem dla pacjentki i jej partnera. Obecnie dzięki metodologii przyjętej przez Akolekara wiemy, że wartość dodatkowego ryzyka utraty ciąży jest niższa, niż uważano wcześniej, i wynosi odpowiednio 0,1% dla amniopunkcji i 0,2% dla biopsji kosmówki. 
W przypadku testu złożonego DR waha się między 90 a 95%, a FPR jest na poziomie 3–5%, w zależności od ośrodka i liczby dodatkowych markerów ultrasonograficznych, takich jak ocena kości nosowej, przepływu w przewodzie żylnym czy zastawce trójdzielnej. W przypadku dodatkowych markerów ultrasonograficznych o ile wyniki w wiodących ośrodkach były bardzo zachęcające, o tyle potem okazywało się, że rzeczywistość różni się od wyidealizowanego świata ze względu na – nazwijmy to – znaczny poziom subiektywizmu i zależność od umiejętności badającego. Co więcej, IPR na poziomie 3–5% oznacza, że co trzydziesta, a nawet co dwudziesta ciężarna znajdzie się w grupie wysokiego ryzyka i będzie miała wykonaną amniopunkcję, ponieważ pozytywna wartość predykcyjna (positive predictive value – PPV) dla trisomii 21 w teście złożonym wynosi ok. 5%. To oznacza, że tylko u 1:20 pacjentek, które znajdą się w grupie wysokiego ryzyka i zostaną skierowane na amniopunkcję, potwierdzi się, że mają chore dziecko. U pozostałych 19 (95%) wynik kariotypu będzie prawidłowy, ale większość z nich nie tyle się ucieszy, że dziecko będzie zdrowe, ile nie będzie ukrywać swojego niezadowolenia, że „niepotrzebnie” zostały narażone na stres. Dotyczy to zwłaszcza młodszych kobiet. 
W przypadku gdy wzrost ryzyka był związany ze zwiększoną przeziernością karku czy obecnością innego markera ultrasonograficznego, pacjentka najczęściej ucieszy się z prawidłowego wyniku i uzna temat za zamknięty, zwłaszcza gdy kolejne badanie USG będzie prawidłowe. 
Natomiast w przypadku nieprawidłowego profilu biochemicznego w teście podwójnym (ocena wolnej podjednostki beta-hCG i białka PAPP-A w surowicy ciężarnej), zwanym potocznie, choć nieprawidłowo, testem PAPP-A, sprawa jest bardziej złożona. Ponieważ dla większości pacjentek, a niestety także dla wielu lekarzy, podstawy matematyki (ułamki!) będące fundamentem badań przesiewowych nie są do końca zrozumiałe, w pewnym momencie zaczęła krążyć opinia, że nie warto robić tych badań biochemicznych, bo może wyjść „błędnie” zwiększone ryzyko trisomii. Nie jest to oczywiście prawda, ale walka z lękiem przed nieznanym nie jest prostą sprawą.

NIPT

W czasie niezwykłej intensyfikacji badań w kierunku poszukiwania kolejnych markerów ultrasonograficznych drugiego rzutu, w większości już dawno zapomnianych, ok. 2011 r. pojawiło się przesiewowe badanie związane z oceną wolnego pozakomórkowego DNA płodu (cell-free fetal DNA), które można wyizolować z surowicy krwi kobiety ciężarnej, zwane obecnie najczęściej NIPT (non-invasive prenatal testing). Dzięki specjalnym technikom można odróżnić frakcję płodową od matczynej i ocenić, czy DNA płodu jest zbudowane prawidłowo. Co ciekawe, odkryto to już w 1997 r., jednakże dopiero wprowadzenie techniki sekwencjonowania nowej generacji (next generation sequencing – NGS) umożliwiło szersze zastosowanie tej technologii i wprowadzenie jej do praktyki klinicznej [3]. 
Czas półtrwania cffDNA jest krótki, rzędu kilku–kilkunastu godzin, dzięki czemu nie ma ryzyka zanieczyszczenia materiałem genetycznym pochodzącym od płodu z poprzedniej ciąży. Ten problemem uniemożliwił wykorzystanie w diagnostyce prenatalnej komórek pochodzenia płodowego, które też można wykryć we krwi ciężarnej. Pierwsze wyniki były obiecujące, ale okazało się, że te komórki mogą być obecne w układzie siateczkowo-śródbłonkowym kobiety jeszcze wiele lat po zakończeniu ciąży.
U każdego z nas w surowicy można znaleźć małe fragmenty DNA, które pochodzą z naszych komórek ulegających apoptozie. U ciężarnej pod koniec I trymestru średnio 10% wolnego DNA stanowi tzw. frakcja płodowa, która gwoli ścisłości pochodzi z ulegających apoptozie komórek trofoblastu, a nie z samego płodu. Czynniki nasilające apoptozę, takie jak palenie papierosów przez ciężarną, powodują zwiększenie odsetka frakcji płodowej, co zwiększa czułość badania. Z drugiej strony u kobiety o znacznie zwiększonej masie ciała frakcja płodowa ulega znacznie większemu rozcieńczeniu w płynach ustrojowych, co zwłaszcza w pierwszych latach stosowania NIPT wpływało niekorzystnie na jego wyniki. Powszechnie przyjmuje się, że wynik NIPT będzie wystarczająco wiarygodny, jeśli frakcja płodowa wynosi ≥ 4%. 
W przeprowadzonym w 2019 r. badaniu stwierdzono, że średnia masa ciała kobiet, u których frakcja płodowa była zbyt mała, wynosiła 78 kg, podczas gdy w grupie kobiet, u których frakcja płodowa wynosiła ≥ 4%, średnia masa ciała była o 14 kg mniejsza (64 kg) [4]. Natomiast odsetek frakcji płodowej w ciążach, w których u płodu występuje zespół Downa, jest większy niż przeciętnie. Niewątpliwie przyczyniło się to do ogromnego sukcesu komercyjnych nieinwazyjnych badań przesiewowych opierających się na analizie frakcji płodowej wolnego pozakomórkowego DNA w surowicy ciężarnej kobiety. Ponieważ ta ostania nazwa jest długa i trudna do powtórzenia, obecnie mówi się najczęściej (nie licząc nazw komercyjnych) o badaniach NIPT (non-invasive prenatal testing). 

Czułość testów NIPT

Jako że zespół Downa jest najczęściej występującą chorobą genetyczną w populacji ogólnej, pojawienie się w 2011 r. na komercyjnym rynku testu, który wykazywał wyjątkowo wysoką czułość w skriningu w kierunku tej choroby, musiało stanowić przełom. Tak też się stało. Przez kilka lat trwały intensywne badania, na początku sponsorowane przez firmy komercyjne (ze względu na wysoki koszt badań opartych na platformach wykorzystujących sekwencjonowanie nowej generacji), w późniejszym okresie finansowane także niezależnie. Po kilku latach wykazano wysoką czułość tej metody także w przypadku trisomii 18, występującej zdecydowanie rzadziej niż trisomia 21, a po kolejnych paru latach i uzbieraniu odpowiedniej liczby przypadków – także trisomii 13, najrzadszej z wszystkich trzech. 
W przypadku trisomii 18 i 13 dodatkową trudność stanowi to, że charakteryzują się one występowaniem wczesnego ograniczenia wzrastania, co jest konsekwencją m.in. małej objętości kosmówki w I trymestrze ciąży. Wiąże się to z jednej strony z niskimi poziomami wolnej podjednostki beta-hCG i białka PAPP-A, a z drugiej – zmniejszonym odsetkiem frakcji płodowej wolnego DNA. Dodatkowo często występujący ograniczony mozaicyzm łożyskowy w trisomii 13 jest odpowiedzialny za większy odsetek wyników fałszywie dodatnich w tym przypadku. Podobna sytuacja ma miejsce w zespole Turnera. W razie wątpliwości pewnym ułatwieniem może być fakt, że w obu tych aberracjach chromosomowych w znacznym odsetku przypadków współistnieją nieprawidłowości strukturalne u płodu, które można wykryć w dokładnym badaniu ultrasonograficznym między 11. a 14. tygodniem ciąży.
Do wyników fałszywie dodatnich może dochodzić w przypadku wczesnego obumarcia jednego z bliźniąt, najczęściej na początku I trymestru. Zdarza się, że pozostałości pęcherzyka ciążowego nie są łatwe do zidentyfikowania i mogą ujść uwadze ultrasonografisty. Do najczęstszych przyczyn obumarcia zarodka na wczesnym etapie ciąży należą aberracje chromosomowe, spośród których na czoło wysuwają się zespół Turnera i trisomia 13. W takim przypadku tkanka kosmówki nie obumiera od razu, ze względu na dobre ukrwienie może być aktywna jeszcze przez kilka tygodni, jednakże zachodzą w niej nasilone procesy apoptozy. To zjawisko prowadzi do obecności we frakcji płodowej nieprawidłowego DNA pochodzącego z obumierającej ciąży bliźniaczej i może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich. Dlatego w takim przypadku dużą przewagę ma wybór metody NIPT, pozwalającej na wiarygodną ocenę frakcji płodowej i odróżnienie frakcji pochodzących od obu bliźniąt [4, 5].
Parametry testów NIPT dla różnych metod i testów komercyjnych mogą się różnić między sobą, jednak najczęściej cytowane wartości to: 

• w ciążach pojedynczych DR wynosi: 
  • 99,7% dla trisomii 21, 
  • 97,9% dla trisomii 18, 
  • 99% dla trisomii 13. 
     

Takie parametry osiągnięto dla FPR wynoszącego 0,04% dla każdej z tych trisomii, co daje sumarycznie 0,12% dla całego testu [6]; 

• dla ciąży bliźniaczej DR i FPR wynoszą odpowiednio: 
  • 98,2 i 0,05% dla trisomii 21, 
  • 88,9 i 0,03% dla trisomii 18, 
  • 66,7 i 0,19% dla trisomii 13, 
    co daje FPR 0,27% dla całego testu [7]. 
     

Jeżeli FPR dla najczęstszych trisomii wynosi 0,12%, to znaczy, że podwyższone ryzyko stwierdzimy w przybliżeniu u 1 na 1000 ciężarnych przebadanych tym testem, co w porównaniu do 1:20 dla testu złożonego brzmi imponująco. 
Jeszcze większe wrażenie robi PPV, która dla trisomii 21 wynosi co najmniej 2:3. Czyli u dwóch z trzech kobiet, u których test wykaże zwiększone ryzyko, potwierdzi się trisomia 21 u dziecka. Dla przypomnienia: dla testu złożonego trisomia 21 potwierdza się w mniej więcej jednym przypadku na 20 procedur inwazyjnych (PPV = 1:20, czyli 5%). Dokładna wartość zależy od przyjętego punktu odcięcia i ewentualnego dodania ultrasonograficznych lub/i biochemicznych markerów dodatkowych, co jeszcze bardziej komplikuje skrining. 

Rekomendacje towarzystw naukowych

Obecnie według wspólnych rekomendacji Polskiego Towarzystwa Ginekologów i Położników oraz Polskiego Towarzystwa Genetyki Człowieka zaleca się u każdej ciężarnej wykonanie testu złożonego według Nicolaidesa, tj. badania USG między 11. a 14. tygodniem ciąży z oceną przezierności karku, pomiarem długości ciemieniowo-siedzeniowej płodu, częstości akcji serca płodu i oceną jego budowy anatomicznej oraz poziomami wolnej podjednostki beta-hCG i białka PAPP-A. 
NIPT jest badaniem drugiego rzutu w grupie tzw. pośredniego ryzyka trisomii, które jest zwykle definiowane jako mieszczące się w przedziale 1:100–1:1000 lub 1:300–1:1000. Powyżej 1:100 zaleca się wykonanie badania inwazyjnego. Poniżej 1:1000 mówimy o grupie niskiego ryzyka, w przypadku której może nie zalecamy jednoznacznie wykonania NIPT, ale pacjentka bezwzględnie musi być poinformowana o takiej możliwości. Wynika to m.in. z przepisów gwarantujących pacjentce prawo do informacji na temat wszystkich dostępnych metod diagnostyki i leczenia (art. 9 Ustawy z dnia 6 listopada 2008 r. o prawach pacjenta i Rzeczniku Praw Pacjenta i art. 31 Ustawy z dnia 5 grudnia 1996 r. o zawodach lekarza i lekarza dentysty). 
W coraz większej liczbie krajów Europy Zachodniej badanie NIPT jest refundowane przez płatnika w powszechnym systemie opieki zdrowotnej. Zgodnie z deklaracjami Ministerstwa Zdrowia można się spodziewać, że w niedalekiej przyszłości testy NIPT będą refundowane także w Polsce. Otwarte pozostaje pytanie, jakie będą kryteria progowe dla refundacji NIPT. Zapewne będzie ona dostępna dla pacjentek, które po przeprowadzeniu tzw. testu złożonego znalazły się w grupie tzw. pośredniego ryzyka. Nie wiadomo tylko, jaki będzie ustalony przedział tego ryzyka – najrozsądniejsze byłoby przyjęcie zakresu 1:300–1:1000, zgodnie z ww. rekomendacjami [8].

Zastosowanie testów NIPT 

Skrining aberracji chromosomów płci

Rekomendacje wielu towarzystw naukowych zgodnie zalecają stosowanie NIPT do skriningu trisomii, a także coraz częściej – aberracji chromosomów płci. Jakkolwiek poszczególne aberracje chromosomów płci są stosunkowo rzadkie, to jednak sumarycznie dotyczą ok. 0,3% wszystkich żywych urodzeń. Najczęściej występują: 

• zespół Turnera (45,X), 
• zespół Klinefeltera (47,XXY), 
• zespół 47,XXX, 
• zespół Jacobsa (47,XYY), 
• zespół 48,XXYY. 
   

Wykrywanie delecji i mikrodelecji

Delecje i mikrodelecje, rzadziej mikroduplikacje, wiążą się z występowaniem różnych chorób i zespołów genetycznych o różnym fenotypie, często obejmującym niepełnosprawność intelektualną, autyzm i inne zaburzenia neurorozwojowe [9, 10].
W zakresie prenatalnego skriningu w kierunku mikrodelecji zalecenia towarzystw naukowych są raczej zachowawcze, jednakże pojawia się coraz więcej danych, które pokazują, że NIPT może stanowić przydatną metodę skrinigu w kierunku niektórych mikrodelecji. Na pewno niecelowe jest wprowadzanie do testu określonych, często niezwykle rzadkich mikrodelecji (występujących z częstością 1:100 000 urodzeń, a nawet rzadziej) czy nawet delecji tylko dlatego, że zmiany do nich prowadzące są duże i łatwe do analizy i interpretacji. 
Należy podkreślić, że mikrodelecje istotne z klinicznego punktu widzenia to najczęściej zmiany mniejsze niż 5 Mpz, a poniżej tej wielkości zdolność do ich wykrywania przez większość testów drastycznie spada. W przypadku trzech z czterech najczęściej występujących zespołów mikrodelecja ma średnią wielkość 0,5–3,45 Mpz. Dlatego ważne jest, aby test NIPT miał zdolność do wykrywania jak najmniejszych zmian, co umożliwia np. stosowana w najnowszych testach technologia celowego wzbogacania płodowego DNA (target capture enriched technology) [4, 5].
Z klinicznego punktu widzenia najważniejsza jest mikrodelecja 22q11.2. Według najnowszych szacunków występuje de novo z częstością nawet 1:1000, czyli większą niż populacyjne ryzyko wystąpienia trisomii 21 dla młodych kobiet (1:1000 to ryzyko trisomii 21 dla kobiety 25-letniej w 12. tygodniu ciąży). W populacji ogólnej mikrodelecja 22q11.2 występuje częściej niż trisomia 18 i 13. Dlatego American College of Medical Genetics rekomenduje od 2022 r. skrining populacyjny w kierunku 22q11.2. 
Inne często badane mikrodelecje to: 

• 1p36 deletion syndrome (1:5000–1:10 000), 
• zespół Smith–Magenis (17p11.2) (1:15 000–1:25 000), 
• zespół Wolfa–Hirschhorna (4p16.3) (1:50 000) [11, 12].
   

Test NIPT w procedurze

Dla pacjentek po zapłodnieniu IVF ważna jest możliwość wykonania testu NIPT w ciąży uzyskanej z komórki dawczyni (nie wszystkie testy na to pozwalają), a także przeprowadzanie skriningu w ciąży po przeprowadzeniu diagnostyki przedimplantacyjnej.

Badania w kierunku chorób monogenowych

Kolejnym etapem w rozwoju NIPT są badania w kierunku chorób monogenowych. Materiał pobiera się zarówno od ciężarnej kobiety (próbka krwi), jak i od biologicznego ojca dziecka (wymaz z policzka). Takie testy są coraz popularniejsze w Stanach Zjednoczonych i Europie Zachodniej, zwłaszcza w niektórych zamkniętych populacjach, gdzie jest zwiększone ryzyko nosicielstwa chorób dziedziczonych autosomalnie recesywnie. Do takich chorób należą m.in. mukowiscydoza i fenyloketonuria. 
Mukowiscydoza jest skutkiem mutacji genu CFTR (dziedziczonej po obojgu rodzicach), a jej częstość występowania w Polsce ocenia się na 1:2300. Mniej więcej jedna na 25 osób jest nosicielem zmutowanego genu. Natomiast fenyloketonuria w Polsce występuje z częstością 1:7000–1:8000, podobnie jak w innych krajach Europy Środkowej.
Dzięki wykonaniu odpowiedniego testu NIPT można uniknąć wielu chorób genetycznych i metabolicznych, których nie potrafimy zdiagnozować prenatalnie (nie ma sensu wykonywać amniopunkcji i badać 100 mutacji, jeżeli nie ma obciążonego wywiadu rodzinnego), a które mogą prowadzić do niewyjaśnionego zgonu płodu w końcowym okresie ciąży lub do urodzenia ciężko chorego dziecka.

Piśmiennictwo

1. Tabor A., Philip J., Madsen M. et al. Randomised controlled trial of genetic amniocentesis in 4606 low-risk women. Lancet 1986; 1 (8493): 1287–1293.
2. Akolekar R., Beta J., Picciarelli G. et al. Procedure related risk of miscarriage following amniocentesis and chorionic villus sampling: a systematic review and meta-analysis. Ultrasound Obstet Gynecol 2015; 45: 16–26.
3. Lo Y.M., Corbetta N., Chamberlain P.F. et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 1997; 350: 485–487.
4. Kypri E., Ioannides M., Touvana E. et al. Non-invasive prenatal testing of fetal chromosomal aneuploidies: validation and clinical performance of the veracity test. Molecular Cytogenetics 2019; 12: 34. 
5. Neofytou M.C., Tsangaras K., Kypri E. et al. Targeted capture enrichment assay for non-invasive prenatal testing of large and small size sub-chromosomal deletions and duplications. PLoS One 2017; 12 (2): e0171319. 
6. Gil M.M., Accurti V., Santacruz B. et al. Analysis of cell-free DNA in maternal blood in screening for aneuploidies: updated meta-analysis. Ultrasound Obstet Gynecol 2017; 50: 302–314.
7. Gil M.M., Galeva S., Jani J. et al. Screening for trisomies by cfDNA testing of maternal blood in twin pregnancy: update of the fetal medicine foundation results and meta-analysis. Ultrasound Obstet Gynecol 2019; 53: 734–742.
8. Sieroszewski P., Haus O., Zimmer M. et al. Recommendations for prenatal diagnostics of the Polish Society of Gynaecologists and Obstetricians and the Polish Society of Human Genetics. Ginekol Pol 2022; 93 (5): 427–437.
9. Watson C.T., Marques-Bonet T., Sharp A.J. et al. The genetics of microdeletion and microduplication syndromes: an update. Annu Rev Genomics Hum Genet 2014; 15: 215–244. 
10. Gropman A.L., Batshaw M.L. Epigenetics, copy number variation, and other molecular mechanisms underlying neurodevelopmental disabilities: new insights and diagnostic approaches. J Dev Behav Pediatr 2010; 31 (7): 582–591.
11. Dungan J.S., Klugman S., Darilek S. et al. Noninvasive prenatal screening (NIPS) for fetal chromosome abnormalities in a general-risk population: An evidence-based clinical guideline of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Genetics in Medicine 2023; 25 (2): 100 336
12. Hui L., Ellis K., Mayen D. et al. Position statement from the International Society for Prenatal Diagnosis on the use of non-invasive prenatal testing for the detection of fetal chromosomal conditions in singleton pregnancies. Penat Diagn 2023; 43 (7): 814–828.