Dołącz do czytelników
Brak wyników

Personalizowana diagnostyka onkologiczna na przykładzie nowotworów piersi i jajnika

Artykuł | 28 lipca 2018 | NR 27
515

Od samego początku stosowania farmakoterapii zauważono, że pacjenci leczeni na tę samą chorobę z zastosowaniem tych samych leków nie odpowiadają na leczenie w sposób identyczny. Innymi słowy, skuteczność tej samej terapii jest różna u różnych pacjentów. Dzieje się tak dlatego, że każdy organizm ma unikalny genom (zbiór wszystkich genów oraz innych sekwencji DNA), który decyduje o wszystkim – począwszy od koloru włosów, oczu, wzrostu, kształtu ciała, rysów twarzy, zdolności do nauki, a skończywszy na predyspozycji do zapadania na choroby cywilizacyjne czy właśnie odpowiedzi na leczenie. 

Korzenie medycyny personalizowanej 

W 1953 r. Watson i Crick, dwaj naukowcy z Uniwersytetu w Cambridge, dokonali epokowego okrycia budowy podwójnej helisy DNA. Stworzyło to podstawy powstania technologii do badania DNA oraz umożliwiło rozwój inżynierii genetycznej. W 1975 r. dzięki pracom Milsteina oraz Koehlera powstała procedura produkcji przeciwciał monoklonalnych. Otworzyło to nowe możliwości diagnostyczne (immunohistochemia – IHC) oraz terapeutyczne (przeciwciała monoklonalne). W 1990 r. Departament Energii USA oraz Narodowe Instytuty Zdrowia USA rozpoczęły projekt poznania ludzkiego genomu. Wkrótce dołączyły do niego inne kraje (Niemcy, Francja, Japonia, Chiny i Wielka Brytania). W tym samym czasie prace nad poznaniem ludzkiego genomu rozpoczął Craig Venter, biznesmen, filantrop, założyciel firmy Celera Genomics.

POLECAMY

Dzięki ogromnemu wysiłkowi międzynarodowego konsorcjum oraz konkurencji z firmą Celera Genomics już w roku 2000 opublikowano pierwszą wersję genomu człowieka. Koszt tego przedsięwzięcia zamknął się astronomiczną kwotą 3 mld dolarów. Ukończenie tego projektu znacznie przyspieszyło rozwój medycyny personalizowanej, zwanej także medycyną precyzyjną (MP). Medycyna personalizowana to prowadzenie wielospecjalistycznego leczenia w sposób zindywidualizowany w oparciu o szczegółowe dane diagnostyczne, w tym genetyczne. To inaczej podanie właściwego leku, właściwemu pacjentowi, we właściwym czasie.

Dynamiczny rozwój sektora biotechnologicznego przyniósł w latach 90. XX w. pierwsze leki z tzw. grupy terapii celowanej. Terapia celowana to terapia ukierunkowana molekularnie, która wykorzystuje leki (przeciwciała monoklonalne lub drobnocząsteczkowe inhibitory), które zwykle blokują określony defekt molekularny, np. zmutowane białko, które ciągle stymuluje komórkę nowotworową do podziału. Prowadzenie leczenia w sposób personalizowany wymaga zaawansowanych metod diagnostycznych, takich jak IHC, łańcuchowa reakcja polimeryzacji (ang. polymerase chain reaction – PCR) i jej odmiany, sekwencjonowanie DNA metodą Sangera oraz sekwencjonowanie następnej generacji (ang. next generation sequencing – NGS) (tab. 1). Należy nadmienić, że obecny koszt sekwencjonowania genomu ludzkiego wynosi 1363 dolary i trwa tylko 3 dni. Pokazuje to, jak ogromny postęp dokonał się w ciągu ostatnich 15 lat w porównaniu do technologii wykorzystywanej w trakcie sekwencjonowania pierwszego ludzkiego genomu. Pierwotną metodą stosowaną w MP była IHC wykorzystana do stratyfikacji pacjentek z rakiem piersi [1, 2]. 

Tab. 1. Metody stosowane w diagnostyce molekularnej w MP

Metoda Zalety Wady
immunohistochemia (IHC) rutynowo stosowana w patologii, 
nie wymaga drogiego sprzętu, można ocenić rozmieszczenie ekspresji 
w tkance oraz zidentyfikować typ komórek wykazujących ekspresję badanego białka 
subiektywność oceny, metoda jakościowa
fluorescencyjna 
hybrydyzacja in situ
(ang. fluorescent in situ 
hybridization – FISH)
rutynowo stosowana w diagnostyce, jednoznaczna do oceny złożona, wymaga mikroskopu fluorescencyjnego, badanie 
jest kosztowne 
sekwencjonowanie metodą Sangera złoty standard diagnostyki molekularnej, wykrywa wszystkie mutacje i je identyfikuje czasochłonna, czułość tylko 
10–20%, wymaga drogiego sprzętu
PCR z detekcją w czasie 
rzeczywistym 
(ang. real time PCR), 
qPCR (ang. quantitative PCR)
szybka, mniej wrażliwa na degradacje DNA, czułość ok. 1–5%, na rynku 
są dostępne testy CE-IVD
wykrywa tylko znane mutacje
sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) wykrywa wszystkie mutacje 
i je identyfikuje, bardzo duża 
i kompleksowa liczba informacji w przypadku analizy wielu próbek w jednym eksperymencie, koszt pojedynczej próbki niski, czułość 1–5%, choć zależy od liczby próbek 
w jednym eksperymencie
długi czas trwania badania 
(ok. 5 dni), drogi cały eksperyment, wymaga zaawansowanego sprzętu, złożona analiza bioinformatyczna

Rak piersi z nadekspresją receptora HER2

Jednym z pierwszych leków terapii celowanej było przeciwciało monoklonalne herceptyna zastosowanie w leczeniu subtypu raka piersi z nadekspresją receptora HER2, które wprowadzono do użytku pod koniec lat 90. XX w. Ten typ raka piersi wykrywa się u ok. 20% wszystkich pacjentek z rakiem piersi. Herceptyna, wiążąc się do receptora HER2, powoduje zablokowanie jego działania oraz zatrzymanie podziałów komórkowych. Dzięki zastosowaniu tego leku udało się zmienić bardzo niekorzystny przebieg tej choroby. Do dziś żyją niektóre pacjentki, u których w latach 90. XX w. zastosowano herceptynę. Podawanie herceptyny przez jeden rok po operacji raka piersi z nadekspresją receptora HER2 zmniejsza ryzyko nawrotu o ok. 50%. Niemal jednocześnie pojawił się na rynku test IHC do oznaczania poziomu ekspresji receptora HER2 (białko) na komórkach raka piersi. Obecnie jest to rutynowo wykorzystywane badanie w przypadku diagnostyki raka piersi. Część wyników uzyskiwanych za pomocą metody IHC jest niejednoznacznych i wymaga oceny statusu genu (obecność lub brak amplifikacji – zwielokrotnienia liczby kopii genu) kodującego receptor HER2 z wykorzystaniem metody FISH. Mimo tej stratyfikacji odpowiedź na leczenie nie jest taka sama u wszystkich pacjentów. Prawdopodobnie za zróżnicowaną odpowiedź na leczenie odpowiadają mutację w innych genach kodujących białka składowe szlaku poniżej działania receptora HER2 oraz w innych alternatywnych szlakach przewodzenia sygnału. Obecnie w celu poznania molekularnego podłoża oporności stosuje się metody wielkoskalowe, w tym NGS. Trwają intensywne badania nad rozwikłaniem zagadnienia różnej odpowiedzi na trastuzumab pomimo stratyfikacji molekularnej. Prace badawcze dotyczą również predyspozycji
do powstania ostrej kardiotoksyczności, która dotyczy kilku procent pacjentek leczonych herceptyną. Prawdopodobnie w niedalekiej przyszłości do kwalifikacji pacjentek do leczenia herceptyną, obok badania ekspresji HER2, będzie dodatkowo oceniany panel kilkunastu do kilkudziesięciu genów [3]. 

Rak jajnika

Rak jajnika jest jednym z najbardziej agresywnych nowotworów rozpoznawanych u kobiet. Według Krajowego Rejestru Nowotworowego rocznie w naszym kraju rozpoznaje się 3500 przypadków, zaś 2500 kobiet umiera z powodu tego nowotworu. Wyniki leczenia nie są zadowalające, ponieważ 70% raków jajnika wykrywa się w wysokim stadium zaawansowania (III i IV), gdzie 5-letnie przeżycie wynosi tylko 25%. Około 30% raków jajnika wykrywa się w I–II stopniu zaawansowania z 5-letnim przeżyciem sięgającym ok. 90%. Przyczyną tego niekorzystnego stanu jest fakt, że rak jajnika rozwija się bezobjawowo. Nie ma żadnych markerów biochemicznych użytecznych we wczesnym wykrywaniu tej choroby. Podstawową metodą leczenia jest chirurgia oraz chemioterapia oparta na związkach  platyny.

Niedawno wprowadzono do leczenia raka jajnika inhibitory poli-ADP rybozy-1 (PARP-1) (drobnocząsteczkowe inhibitory), które wykazują skuteczność u pacjentek z mutacjami w genach BRCA1/2. Częstość mutacji dziedzicznych (germinalne) w BRCA1/2 u pacjentek z rakiem jajnika wynosi ok. 18%. Kolejne 8% pacjentek ma mutacje somatyczne, tzn. nie dziedziczne, ale powstałe w trakcie rozwoju nowotworu i obecne tylko w komórkach nowotworowych. Dostępne dane literaturowe wskazują, że pacjentki z mutacjami somatycznymi również odpowiadają na leczenie. Produkty białkowe genów BRCA1/2 biorą aktywny udział w naprawie podwójnoniciowych pęknięć w DNA z wykorzystaniem homologicznego mechanizmu naprawy (ang. homologous recombination repair – HRR) [4, 5].

W naszym kraju do niedawna dla poradnictwa genetycznego analizowano tylko tzw. mutacje założycielskie, tj. mutacje charakterystyczne dla danej populacji, które pojawiły się w niej kilkaset lat temu i zostały w niej utrwalone. Do wykrywania mutacji założycielskich stosuje się m.in. PCR oraz odmiany tej techniki (np. qPCR, PCR z fluorescencyjną detekcją w czasie rzeczywistym) i sekwencjonowanie metodą Sangera (tab. 1). W populacji polskiej w zależności od regionu wyróżnia się ok. 3–5 mutacji założycielskich. Jednakże w przypadku rodzin z licznymi zachorowaniami na raka piersi/jajnika w znacznym odsetku nie wykrywa się mutacji założycielskich. Obecnie dzięki rozwojowi technologii sekwencjonowania DNA w postaci NGS można w sposób ekonomiczny analizować całe geny BRCA1/2 lub ich sekwencje kodujące (tab. 1). Gromadzone obecnie dane z populacji polskiej wskazują, że w rodzinach z licznymi zachorowaniami duży odsetek mutacji lokuje się w innych miejscach genów BRCA1/2 niż mutacje założycielskie. Wykrycie mutacji w BRCA1/2 umożliwia poszukiwanie tej mutacji u członków rodziny i pozawala na wykrycie bezobjawowych nosicieli mutacji. Bezobjawowi nosiciele są włączani w program profilaktyczny częstszych badań oraz zaplanowania wespół z ginekologiem, genetykiem klinicznym oraz psychologiem profilaktycznych operacji usunięcia piersi oraz jajników wraz z przydatkami. Zwłaszcza, że skumulowane ryzyko u nosicieli mutacji w BRCA1 do 80. roku życia wynosi 67% dla raka piersi, a dla raka jajnika 45%. W przypadku mutacji w BRCA2 skumulowane ryzyko wynosi 66% dla raka piersi i 12% dla raka jajnika. Jest to szczególnie ważne dlatego, że nie ma specyficznych i użytecznych markerów dla wczesnego wykrywania tej choroby. Istotne jest więc wprowadzenie diagnostyki mutacji w BRCA1/2 za pomocą NGS na jak największa skalę, szczególnie w aspekcie raka jajnika [6–8]. 

Ważne jest również, aby każda pacjentka z diagnozą raka jajnika została skierowana do poradni genetycznej w celu analizy rodowodowej oraz zlecenia badania genetycznego. W niektórych krajach Europy Zachodniej diagnostykę mutacji w BRCA1/2 rozpoczyna się w tkance pooperacyjnej raka jajnika w celu szybkiego otrzymania informacji na temat podatności na leczenie inhibitorami PARP-1. Po wykonaniu badania BRCA1/2 z tkanki, które zleca ginekolog, pacjentka otrzymuje skierowanie do poradni genetycznej w celu oceny rodowodowej oraz ewentualnego wykonania potwierdzenia obecności mutacji wykrytej uprzednio w tkance w DNA wyizolowanym z krwi pacjentki.

Zastosowanie NGS do analizy wszystkich sekwencji kodujących w BRCA1/2 to większa szansa na wykrycie mutacji w tych genach dla kwalifikacji pacjenta do leczenia inhibitorami PARP-1. Wspomniana wyżej obecność somatycznych mutacji w BRCA1/2 w tkance nowotworowej potencjalnie rozszerza grupę, która może odnieść korzyść z terapii celowanej. Udowodniono, że mutacje w tkance nowotworowej utrwalonej w formalnie i zatopionej w parafinie można z powodzeniem wykrywać, stosując metodę NGS, która jest w stanie identyfikować subklonalne (będące w mniejszości w porównaniu do klonu dominującego, budującego większość masy guza) populacje komórek nowotworowych. Należy dodać, że jest szereg innych genów (np. PTEN, RAD51 C, ATM, ATR), w których mutacje mogą prowadzić do defektów w HRR, a tym samym uwrażliwić komórki nowotworowe na inhibitory PARP-1. Badanie wielu genów w sposób ekonomiczny jest już możliwe dzięki wspomnianej technologii NGS. Obecnie w krajach Europy Zachodniej i USA bada się kilkanaście genów związanych z defektem w HRR [5, 9].

Inhibitory PARP-1 stosuje się u tych pacjentek, które obok wspomnianej mutacji germinalnej lub somatycznej w BRCA1/2 wcześniej uzyskały odpowiedź na leczenie związkami platyny. W badaniu rejestracyjnym wykazano, że olaparyb w porównaniu do placebo istotnie statystycznie wydłuża czas przeżycia wolnego od progresji (PFS) u chorych z mutacją w BRCA1/2 o 6,9 miesiąca (11,2 miesiąca vs 4,3 miesiąca). W badaniu rejestracyjnym wykazano, że wpływ leczenia olaparybem na przeżycie całkowite chorych (OS) jest nieistotny w porównaniu do placebo (HR 0,73; 95% CI 0,45-1,17; p=0,19; 34,9 vs 31,9 miesięcy). Jednak dane na ten temat nie są jeszcze dojrzałe (52% zdarzeń w subpopulacji z mutacją BRCA1/2). 

Poza tym część pacjentek (23%) z grupy przyjmującej placebo otrzymało PARPi po wystąpieniu progresji choroby poza protokołem badania (tzw.crossover). Dodatkowa analiza danych z wykluczeniem ośrodków stosujących inhibitory PARP po progresji wykazała: istotną statystycznie redukcję ryzyka zgonu o 48% [HR 0,52; 95% CI: 0,28; 0,97], co przekłada się na różnicę 8,3 miesiąca w porównaniu do placebo (34,9 vs 26,6 miesiąca). Podkreśla się również aspekt selekcji komórek opornych uprzednim leczeniem solami platyny, które wykorzystują ten sam mechanizm upośledzonej HRR i mogą indukować oporność właśnie na później stosowane inhibitory PARP-1. Zagadnienie to wymaga jednak dalszych badań [5, 10, 11, 12, 13].  

Biopsja płynów

Obecnie nie ma metod umożliwiających regularne, czułe i nieinwazyjne monitorowanie skuteczności leczenia. Duże nadzieje upatruje się z analizie krążących komórek nowotworowych (ang. circulating tumour cells – CTC) oraz pozakomórkowego krążącego nowotworowego DNA (ang. circulating tumour DNA – ctDNA) jako tzw. biopsji płynów (ang. liquid biopsy). Krążące komórki nowotworowe to komórki uwalnianie z guza do krwiobiegu. Pozakomórkowe krążące nowotworowe DNA to DNA o długości ok. 150pz również uwolnione do krwiobiegu przez komórki nowotworowe ulegające nekrozie i apoptozie. Narastające w szybkim tempie dane literaturowe wskazują, że dzięki analizie ctDNA można wykryć wznowę o ok. 3–6 miesięcy wcześniej w porównaniu do metod radiologicznych. Daje to klinicyście dodatkowy czas na zmianę nieskutecznego leczenia, zanim nastąpi wznowa na poziomie klinicznym. Dodatkowo dzięki analizie mutacji w CTC czy ctDNA można dobrać odpowiedni inhibitor kolejnego rzutu do zmieniającego się pod wpływem leczenia genotypu komórek nowotworowych [14-16].

Podsumowanie

Resumując, leczenie pacjentów onkologicznych nie jest możliwe bez specjalistycznej diagnostyki w większości wykonywanej zaawansowanymi metodami molekularnymi. Medycyna precyzyjna to nie tylko skuteczniejsze leczenie powodujące znacznie mniej działań niepożądanych. To również racjonalizacja wydatków na opiekę zdrowotną dzięki precyzyjnej stratyfikacji pacjentów do terapii.

Piśmiennictwo

  1. Lander E.S. et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001; 409 (6822): 860–921. 
  2. Gharwan H., Groninger H. Kinase inhibitors and monoclonal antibodies in oncology: clinical implications. Nat Rev Clin Oncol. 2015 Dec 31. [Epub ahead of print].
  3. Arteaga C.L., Sliwkowski M.X., Osborne C.K., Perez E.A., Puglisi F., Gianni L. Treatment of HER2-positive breast cancer: current status and future perspectives. Nat Rev Clin Oncol. 2011; 9 (1): 16–32. 
  4. Zielona Księga – Rak jajnika: zapobieganie, rozpoznawanie, leczenie. Polskie Towarzystwo Onkologiczne przy współpracy Polskiego Towarzystwa Ginekologii Onkologicznej.
  5. Lord C.J., Ashworth A. BRCAness revisited. Nat Rev Cancer. 2016; 16 (2): 110–20. 
  6. Kluska A., Balabas A., Paziewska A., Kulecka M., Nowakowska D., Mikula M., Ostrowski J. New recurrent BRCA1/2 mutations in Polish patients with familial breast/ovarian cancer detected by next generation sequencing. BMC Med Genomics 2015; 8: 19. 
  7. Ratajska M., Krygier M., Stukan M., Kuźniacka A., Koczkowska M. et al. Mutational analysis of BRCA1/2 in a group of 134 consecutive ovarian cancer patients. Novel and recurrent BRCA1/2 alterations detected by next generation sequencing. J Appl Genet. 2015; 56 (2): 193–8. 
  8. Hartmann L.C., Lindor N.M. The Role of Risk-Reducing Surgery in Hereditary Breast and Ovarian Cancer. N Engl J Med. 2016; 374 (5): 454–68. 
  9. Ellison G., Huang S., Carr H., Wallace A., Ahdesmaki M. et al. A reliable method for the detection of BRCA1 and BRCA2 mutations in fixed tumour tissue utilising multiplex PCR-based targeted next generation sequencing. BMC Clin Pathol. 2015; 15: 5. 
  10. Kaufman B., Shapira-Frommer R., Schmutzler R.K., Audeh M.W., Friedlander M. et al. Olaparib monotherapy in patients with advanced cancer and a germline BRCA1/2 mutation. J Clin Oncol. 2015; 33 (3): 244–50.
  11. Hennessy B.T., Timms K.M., Carey M.S., Gutin A., Meyer L.A. et al.Somatic mutations in BRCA1 and BRCA2 could expand the number of patients that benefit from poly (ADP ribose) polymerase inhibitors in ovarian cancer. J Clin Oncol. 2010; 28 (22): 3570–6. 
  12. Ledermann J et al. Olaparib maintenance therapy in patients with platinum-sensitive relapsed serous ovarian cancer: a preplanned retrospective analysis of outcomes by BRCA status in a randomised phase 2 trial. Lancet Oncol. 2014 Jul;15(8):852-61. doi: 10.1016/S1470-2045(14)70228-1. Epub 2014 May 31.
  13. Matulonis U.A. et al. Olaparib maintenance therapy in patients with platinum-sensitive relapsed serous ovarian cancer and a BRCA mutation: Overall survival adjusted for post-progression PARP inhibitor therapy. Gynecologic Oncology Volume 137, Supplement 1, April 2015, Pages 8 Abstracts Presented for the 46th SGO Annual Meeting on Women’s Cancer Annual Meeting on Women’s Cancer
  14. Alix-Panabières C., Schwarzenbach H., Pantel K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Annu Rev Med. 2012;63:199-215. 15. Maheswaran S., Sequist L.V., Nagrath S. et al. Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells. N Engl J Med 2008; 359 (4): 366–77.
  15. Forshew T., Murtaza M., Parkinson C. et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci Transl Med 2012; 4 (136): 136–68.

Przypisy