Dołącz do czytelników
Brak wyników

Profil ekspresji genów związanych z regulacją angiogenezy w tkance tłuszczowej w raku endometrium

Artykuł | 30 czerwca 2018 | NR 37
192

W latach 1994–1999 na terenie woj. śląskiego rozpoznano 2767 przypadków raka trzonu macicy (średnio 461 zarejestrowanych przypadków rocznie), co stanowi 6,9% ogółu zachorowań na nowotwory złośliwe wśród kobiet w województwie i 25,7% z zachorowań na nowotwory narządów moczowo-płciowych.

W latach 1994–1999 na terenie woj. śląskiego rozpoznano 2767 przypadków raka trzonu macicy (średnio 461 zarejestrowanych przypadków rocznie), co stanowi 6,9% ogółu zachorowań na nowotwory złośliwe wśród kobiet w województwie i 25,7% z zachorowań na nowotwory narządów moczowo-płciowych [1].

Wśród mieszkanek woj. śląskiego najwięcej przypadków nowotworów złośliwych trzonu macicy zdiagnozowano w grupie wiekowej 60–64 lat.

Standaryzowane współczynniki zachorowalności na raka trzonu macicy, przy uwzględnieniu 36 jednostek administracyjnych wskazują na statystycznie znamienny wzrost zachorowalności na ten nowotwór w 15 (88%) miastach i utrzymującą się wysoką, przy p < 0,01, zachorowalność w pow. cieszyńskim i pow. mikołowskim, przy p < 0,05 [1].

MacMahon zidentyfikował czynniki ryzyka dla raka endometrium i podzielił je na trzy kategorie: pewne warianty anatomii i fizjologii, wyraźna nieprawidłowość lub choroba oraz narażenie na egzogenne kancerogeny [2]. Otyłość, brak potomstwa oraz późno występująca menopauza są odmianami prawidłowej anatomii i fizjologii typowo związanymi z rakiem endometrium. Jeżeli pacjentka jest nieródką, kobietą otyłą, a menopauza wystąpiła u niej w wieku 52 lat lub później, to ryzyko rozwoju raka endometrium jest u niej 5-krotnie większe niż u kobiety niespełniającej tych kryteriów [2]. 

Pionierem badań nad angiogenezą był Judah Folkman, który w 1971 r. opublikował na łamach „New England Journal of Medicine”, hipotezę, że wzrost guza uzależniony jest od angiogenezy i że zahamowanie tego procesu może mieć działanie terapeutyczne [3].

Niewątpliwie zasadniczym elementem morfologicznym angiogenezy jest proces powstawania nowych naczyń krwionośnych w podścielisku, na wyraźny sygnał angiogennego fenotypu komórki nowotworowej (ryc. 1) [4]. W procesie tym uczestniczy kilkadziesiąt czynników pro- i antyangiogennych, a szczególną rolą przypisuje się czynnikom z rodziny czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (vasclar endothelial growth factor – VEGF) oraz formom alternatywnego składania mRNA jego genu wraz z systemem receptorów, których molekularna regulacja wprowadza dodatkowe trudności w pełnym poznaniu tego procesu (tab. 1) [5]. 

Pomimo molekularnej złożoności angio- i limfangiogenezy, potencjalne znaczenie badań tych zjawisk ma kliniczne uzasadnienie i wytycza ich zasadnicze kierunki: poznanie czynników wpływających na proliferację nowotworu, poszukiwanie nowych czynników prognostycznych i markerów diagnostycznych oraz wytyczenie nowych celów diagnostyczno-terapeutycznych [7].

Jednym z trzech procesów angiogenezy jest powstawanie naczyń nowotworowych z najbliżej położonych naczyń drogą aktywacji, proliferacji i migracji komórek śródbłonka, dezintegracji błony podstawnej, odsunięcia perycytów oraz tworzenia sieci naczyń ustanawiających połączenia z już istniejącymi [8]. Innymi formami angiogenezy są proces wgłobienia, czyli rozpad naczynia większego na mniejsze, oraz waskulogenna mimikra (ryc. 1) – powstawanie struktur naczyniopodobnych imitujących prawidłowe naczynia [8].

Powstające naczynia, w przeciwieństwie do prawidłowych, tworzonych z mezodermalnych komórek prekursorowych – angioblastów w procesie waskulogenezy, mają wiele nietypowych rozgałęzień, pętli i połączeń bardzo dobrze widocznych w badaniu kolposkopowym szyjki macicy i są opisywane jako kleksowate, twistujące, wężowate lub rurki endotelialne i tworzą obraz punkcikowania, poletkowania oraz mozaiki [9], wskazując tym samym na istotny fakt, że proces angiogenezy rozpoczyna się już na etapach procesu przednowotworowego [10].

Wczesne prace badawcze na temat udziału angiogenezy w biologii nowotworów, przedstawiły dość powszechnie akceptowaną opinię, że guz nowotworowy może wzrastać bez konieczności budowania nowej sieci naczyniowej, tj. tzw. awaskularny wzrost guza – do 1*–2 mm (populacja 105–106 komórek nowotworowych). Hipoteza ta nie znalazła potwierdzenia w badaniach Li i wsp., którzy wykazali, że obecność już 20–50 komórek mających „złośliwy” molekularny fenotyp angiogenny wystarczy do zainicjowania procesu angiogenezy, potwierdzając tym samym hipotezę o jego genetycznym zdeterminowaniu [11].

W drugim założeniu angiogeneza w rozwijającym się guzie nowotworowym jest częścią unikalnego pod względem złożoności procesu karcinogenezy, u którego podstaw leży fakt nabywania przez komórkę nowotworową fenotypu angiogennego – „dominującego złośliwego” – w wyniku licznych zaburzeń molekularnej regulacji komórki [12]. 

Od czasu identyfikacji w 1994 r. leptyny, hormonu wytwarzanego przez adipocyty, tkanka tłuszczowa stała się obiektem wnikliwych badań, które przyczyniły się do odkrycia, że komórki tkanki tłuszczowej są zdolne do syntezy i wydzielania biologicznie czynnych substancji, zwanych adipokinami [13].

Bieżące badania dowiodły, że leptyna ma zdolność wzmagania proliferacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych z siłą działania podobną do tej, jaką wykazuje VEGF [14]. Leptyna ma zdolność stymulowania procesu angiogenezy synergistycznie z dwoma innymi kluczowymi czynnikami proangiogennymi, tj. z czynnikiem wzrostu fibroblastów 2 (fibroblast growth factor – FGF-2) i VEGF [15]. Ponadto leptyna zwiększa ekspresję genów zaangażowanych w proces angiogenezy, tj. MMP-2 (matrix metalloproteinases 2) i MMP-9 (matrix metalloproteinases 9) [16]. Prawidłowa tkanka tłuszczowa jest bogato unaczyniona, a sprawna sieć naczyniowa zaopatruje adipocyty w tlen i składniki odżywcze oraz usuwa produkty przemiany materii. W przypadku nadmiernego rozrostu tkanki tłuszczowej pojawiające się regionalne niedotlenienie powoduje nadekspresję genu i wzmożoną produkcję czynnika indukowanego niedotlenieniem (hypoxia inducible factor 1α – HIF-1α), który wpływa na ekspresję genów odpowiedzialnych za aktywację procesów indukujących tworzenie nowych naczyń [17]. 

Cel pracy

Celem przedstawionych badań jest typowanie genów uczestniczących w regulacji angiogenezy, zmieniających swoją aktywność transkrypcyjną w zależności od stopnia zróżnicowania histopatologicznego gruczolakoraka endometrium, które mogłyby stanowić uzupełniające markery diagnostyczne, prognostyczne a także cel terapeutyczny.

Materiał i metody

Materiałem badawczym były wycinki brzusznej tkanki tłuszczowej w grupie 36 kobiet, w tym chorych na raka endometrium w pierwszym stopniu klinicznego zaawansowania i w różnych stopniach zróżnicowania histopatologicznego G1–G3 (grupa badana) oraz pacjentek zakwalifikowanych do usunięcia macicy ze względu na łagodną patologię narządów płciowych (grupa kontrola). Kryterium wykluczenia z udziału w badaniu objęło kobiety, u których w wywiadzie lub pooperacyjnym badaniu histopatologicznym rozpoznana została postać nowotworu złośliwego inna niż gruczolakorak endometrium typu endometrioidalnego (EEC). Pozostałe kryteria wykluczenia stanowiły stwierdzony rozrost endometrium z atypią lub bez niej w pooperacyjnym badaniu histopatologicznym, stosowanie hormonalnej terapii zastępczej w ciągu 5 lat przed operacją oraz skrajna otyłość, definiowana jako wskaźnik masy ciała (body mass index – BMI) > 40. 

Metoda analizy molekularnej wycinków brzusznej tkanki tłuszczowej obejmowała ekstrakcję całkowitego RNA z użyciem odczynnika TRIzol® (Invitrogen Life Technologies, USA, No 15 596-026) zgodnie z zaleceniami producenta, a następnie oczyszczanie otrzymanych ekstraktów z użyciem zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Niemcy, nr kat. 74 106) z użyciem kolumienek i Dnazy I (RNase-Free DNase Set, Qiagen Inc., Niemcy, nr kat. 79 254) zgodnie z zaleceniami producenta oraz analizę profilu ekspresji genów wyznaczonego techniką mikromacierzy oligonukleotydowych z zastosowaniem płytek HG-U133-A (Affymetrix). Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzono dla 691 mRNA genów kodujących białka związane z regulacją aktywności angiogenezy, wybranych na podstawie danych literaturowych oraz bazy danych NCBI i Affymetrix. Analiza statystyczna otrzymanych wyników została wykonana z wykorzystaniem Infrastruktury PL-Grid (//www.plgrid.pl).

Wyniki

Wyniki prezentujące profile stężeń mRNA w wycinkach endometrium o różnym stopniu zróżnicowania histopatologicznego gruczolakoraka wyznaczono metodą mikromacierzy ekspresyjnych, z zastosowaniem płytek HG-U133 A (Affymetrix). Ocenę zróżnicowania grup badanych

transkryptomów, rozpoczęto od normalizacji otrzymanych wyników za pomocą programu RMA Express (ryc. 2). 
W kolejnym etapie badań, przeprowadzono grupowanie hierarchiczne danych, umożliwiające wstępną ocenę podobieństwa profilu stężeń mRNA w badanych wycinkach endometrium (ryc. 3). 

Poszukując odpowiedzi na pytanie, które z obserwowanych różnic poziomu mRNA są statystycznie znamienne, przeprowadzono jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA, umożliwiającą porównanie kilku średnich bez przeprowadzania kilku testów t. Otrzymany wynik wskazuje, że w grupie 691 mRNA liczba mRNA różnicujących grupy wycinków gruczolakoraka endometrium zmienia się w zależności od siły różnicowania. Przy wartości p < 0,05 – p < 0,001 liczba mRNA wynosi od 203 mRNA do 45 mRNA (tab. 2A). 

Kontynuując analizę wariancji metodą wielokrotnych porównań – każdej średniej z każdą, z zastosowaniem testu post-hoc Tukey, uzyskano bardziej szczegółowe informacje dotyczące różnic stężenia mRNA pomiędzy poszczególnymi grupami transkryptomów (tab. 2B).

Otrzymany wynik wskazuje, że, liczba mRNA różnicujących G1 vs K = 27 mRNA, G2 vs K = 113 mRNA oraz G3 vs K = 81 mRNA przy założeniu, że wartość p < 0.05 (tab. 2B). Specyficzność mRNA w różnicowaniu poszczególnych grup pomiędzy sobą oceniono na podstawie diagramu Venna (ryc. 4). 

Uzyskane wyniki wskazują, że 6 mRNA zawsze różnicowało grupy wycinków tkanki tłuszczowej gruczolakoraka endometrium od kontroli, niezależnie od stopnia zróżnicowania histopatologicznego, podczas gdy liczba specyficznych mRNA dla różnicowania tylko G1 vs K = 15, G2 vs K = 43 oraz G3 vs K = 15 mRNA (ryc. 3).

Ten etap analizy zakończono testem nadreprezentatywności w programie PANTHER – Gene List Analysis, umożliwiającym wytypowanie pośród mRNA różnicujących te cząsteczki, które mają istotne znaczenie dla angiogenezy nowotworowej (tab. 3). Otrzymane wyniki wskazują, że dla gruczolakoraka endometrium w stopniu zróżnicowania G1 są to cząsteczki mRNA trzech genów: ENG (TGFBR3), EDIL3 oraz NRP2, charakteryzujące się istotnym wzrostem stężenia w odniesieniu do grupy porównawczej (tab. 3). 

Test nadreprezentatywności wskazuje brak mRNA różnicujących gruczolakoraka od kontroli, które byłyby charakterystyczne dla wszystkich stadiów zróżnicowania histopatologicznego (G1 vs K, G2 vs K oraz G3 vs K). Podobnie nie wykazano mRNA istotnych dla angiogenezy nowotworowej wspólnych dla G1 vs K i G2 vs K oraz G1 vs K i G3 vs K (tab. 3).

Omówienie wyników

Połączenie metod morfologicznych z dobrze poznaną biologią zmian przednowotworowych i inwazyjnych z technikami biologii molekularnej umożliwiającymi jednorazową ocenę ekspresji kilku tysięcy genów znacznie zwiększa precyzję diagnostyki i terapii oraz stanowi klucz do zastosowania terapii molekularnie ukierunkowanej (terapia celowana) u chorych na nowotwory. Możliwość użycia kryteriów molekularnych do doboru właściwej terapii dla danego pacjenta spowodowała gwałtowny rozwój medycyny...

Pozostałe 70% treści dostępne jest tylko dla Prenumeratorów.

Co zyskasz, kupując prenumeratę?
  • 6 wydań czasopisma "Forum Położnictwa i Ginekologii"
  • Nielimitowany dostęp do całego archiwum czasopisma
  • Zniżki w konferencjach organizowanych przez redakcję
  • ...i wiele więcej!
Sprawdź

Przypisy