Profil ekspresji genów związanych z regulacją angiogenezy w tkance tłuszczowej w raku endometrium

W latach 1994–1999 na terenie woj. śląskiego rozpoznano 2767 przypadków raka trzonu macicy (średnio 461 zarejestrowanych przypadków rocznie), co stanowi 6,9% ogółu zachorowań na nowotwory złośliwe wśród kobiet w województwie i 25,7% z zachorowań na nowotwory narządów moczowo-płciowych [1].

Wśród mieszkanek woj. śląskiego najwięcej przypadków nowotworów złośliwych trzonu macicy zdiagnozowano w grupie wiekowej 60–64 lat.

Standaryzowane współczynniki zachorowalności na raka trzonu macicy, przy uwzględnieniu 36 jednostek administracyjnych wskazują na statystycznie znamienny wzrost zachorowalności na ten nowotwór w 15 (88%) miastach i utrzymującą się wysoką, przy p < 0,01, zachorowalność w pow. cieszyńskim i pow. mikołowskim, przy p < 0,05 [1].

MacMahon zidentyfikował czynniki ryzyka dla raka endometrium i podzielił je na trzy kategorie: pewne warianty anatomii i fizjologii, wyraźna nieprawidłowość lub choroba oraz narażenie na egzogenne kancerogeny [2]. Otyłość, brak potomstwa oraz późno występująca menopauza są odmianami prawidłowej anatomii i fizjologii typowo związanymi z rakiem endometrium. Jeżeli pacjentka jest nieródką, kobietą otyłą, a menopauza wystąpiła u niej w wieku 52 lat lub później, to ryzyko rozwoju raka endometrium jest u niej 5-krotnie większe niż u kobiety niespełniającej tych kryteriów [2]. 

Pionierem badań nad angiogenezą był Judah Folkman, który w 1971 r. opublikował na łamach „New England Journal of Medicine”, hipotezę, że wzrost guza uzależniony jest od angiogenezy i że zahamowanie tego procesu może mieć działanie terapeutyczne [3].

Niewątpliwie zasadniczym elementem morfologicznym angiogenezy jest proces powstawania nowych naczyń krwionośnych w podścielisku, na wyraźny sygnał angiogennego fenotypu komórki nowotworowej (ryc. 1) [4]. W procesie tym uczestniczy kilkadziesiąt czynników pro- i antyangiogennych, a szczególną rolą przypisuje się czynnikom z rodziny czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (vasclar endothelial growth factor – VEGF) oraz formom alternatywnego składania mRNA jego genu wraz z systemem receptorów, których molekularna regulacja wprowadza dodatkowe trudności w pełnym poznaniu tego procesu (tab. 1) [5]. 

Pomimo molekularnej złożoności angio- i limfangiogenezy, potencjalne znaczenie badań tych zjawisk ma kliniczne uzasadnienie i wytycza ich zasadnicze kierunki: poznanie czynników wpływających na proliferację nowotworu, poszukiwanie nowych czynników prognostycznych i markerów diagnostycznych oraz wytyczenie nowych celów diagnostyczno-terapeutycznych [7].

Jednym z trzech procesów angiogenezy jest powstawanie naczyń nowotworowych z najbliżej położonych naczyń drogą aktywacji, proliferacji i migracji komórek śródbłonka, dezintegracji błony podstawnej, odsunięcia perycytów oraz tworzenia sieci naczyń ustanawiających połączenia z już istniejącymi [8]. Innymi formami angiogenezy są proces wgłobienia, czyli rozpad naczynia większego na mniejsze, oraz waskulogenna mimikra (ryc. 1) – powstawanie struktur naczyniopodobnych imitujących prawidłowe naczynia [8].

Powstające naczynia, w przeciwieństwie do prawidłowych, tworzonych z mezodermalnych komórek prekursorowych – angioblastów w procesie waskulogenezy, mają wiele nietypowych rozgałęzień, pętli i połączeń bardzo dobrze widocznych w badaniu kolposkopowym szyjki macicy i są opisywane jako kleksowate, twistujące, wężowate lub rurki endotelialne i tworzą obraz punkcikowania, poletkowania oraz mozaiki [9], wskazując tym samym na istotny fakt, że proces angiogenezy rozpoczyna się już na etapach procesu przednowotworowego [10].

Wczesne prace badawcze na temat udziału angiogenezy w biologii nowotworów, przedstawiły dość powszechnie akceptowaną opinię, że guz nowotworowy może wzrastać bez konieczności budowania nowej sieci naczyniowej, tj. tzw. awaskularny wzrost guza – do 1*–2 mm (populacja 105–106 komórek nowotworowych). Hipoteza ta nie znalazła potwierdzenia w badaniach Li i wsp., którzy wykazali, że obecność już 20–50 komórek mających „złośliwy” molekularny fenotyp angiogenny wystarczy do zainicjowania procesu angiogenezy, potwierdzając tym samym hipotezę o jego genetycznym zdeterminowaniu [11].

W drugim założeniu angiogeneza w rozwijającym się guzie nowotworowym jest częścią unikalnego pod względem złożoności procesu karcinogenezy, u którego podstaw leży fakt nabywania przez komórkę nowotworową fenotypu angiogennego – „dominującego złośliwego” – w wyniku licznych zaburzeń molekularnej regulacji komórki [12]. 

Od czasu identyfikacji w 1994 r. leptyny, hormonu wytwarzanego przez adipocyty, tkanka tłuszczowa stała się obiektem wnikliwych badań, które przyczyniły się do odkrycia, że komórki tkanki tłuszczowej są zdolne do syntezy i wydzielania biologicznie czynnych substancji, zwanych adipokinami [13].

Bieżące badania dowiodły, że leptyna ma zdolność wzmagania proliferacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych z siłą działania podobną do tej, jaką wykazuje VEGF [14]. Leptyna ma zdolność stymulowania procesu angiogenezy synergistycznie z dwoma innymi kluczowymi czynnikami proangiogennymi, tj. z czynnikiem wzrostu fibroblastów 2 (fibroblast growth factor – FGF-2) i VEGF [15]. Ponadto leptyna zwiększa ekspresję genów zaangażowanych w proces angiogenezy, tj. MMP-2 (matrix metalloproteinases 2) i MMP-9 (matrix metalloproteinases 9) [16]. Prawidłowa tkanka tłuszczowa jest bogato unaczyniona, a sprawna sieć naczyniowa zaopatruje adipocyty w tlen i składniki odżywcze oraz usuwa produkty przemiany materii. W przypadku nadmiernego rozrostu tkanki tłuszczowej pojawiające się regionalne niedotlenienie powoduje nadekspresję genu i wzmożoną produkcję czynnika indukowanego niedotlenieniem (hypoxia inducible factor 1α – HIF-1α), który wpływa na ekspresję genów odpowiedzialnych za aktywację procesów indukujących tworzenie nowych naczyń [17]. 

Cel pracy

Celem przedstawionych badań jest typowanie genów uczestniczących w regulacji angiogenezy, zmieniających swoją aktywność transkrypcyjną w zależności od stopnia zróżnicowania histopatologicznego gruczolakoraka endometrium, które mogłyby stanowić uzupełniające markery diagnostyczne, prognostyczne a także cel terapeutyczny.

Materiał i metody

Materiałem badawczym były wycinki brzusznej tkanki tłuszczowej w grupie 36 kobiet, w tym chorych na raka endometrium w pierwszym stopniu klinicznego zaawansowania i w różnych stopniach zróżnicowania histopatologicznego G1–G3 (grupa badana) oraz pacjentek zakwalifikowanych do usunięcia macicy ze względu na łagodną patologię narządów płciowych (grupa kontrola). Kryterium wykluczenia z udziału w badaniu objęło kobiety, u których w wywiadzie lub pooperacyjnym badaniu histopatologicznym rozpoznana została postać nowotworu złośliwego inna niż gruczolakorak endometrium typu endometrioidalnego (EEC). Pozostałe kryteria wykluczenia stanowiły stwierdzony rozrost endometrium z atypią lub bez niej w pooperacyjnym badaniu histopatologicznym, stosowanie hormonalnej terapii zastępczej w ciągu 5 lat przed operacją oraz skrajna otyłość, definiowana jako wskaźnik masy ciała (body mass index – BMI) > 40. 

Metoda analizy molekularnej wycinków brzusznej tkanki tłuszczowej obejmowała ekstrakcję całkowitego RNA z użyciem odczynnika TRIzol® (Invitrogen Life Technologies, USA, No 15 596-026) zgodnie z zaleceniami producenta, a następnie oczyszczanie otrzymanych ekstraktów z użyciem zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Niemcy, nr kat. 74 106) z użyciem kolumienek i Dnazy I (RNase-Free DNase Set, Qiagen Inc., Niemcy, nr kat. 79 254) zgodnie z zaleceniami producenta oraz analizę profilu ekspresji genów wyznaczonego techniką mikromacierzy oligonukleotydowych z zastosowaniem płytek HG-U133-A (Affymetrix). Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzono dla 691 mRNA genów kodujących białka związane z regulacją aktywności angiogenezy, wybranych na podstawie danych literaturowych oraz bazy danych NCBI i Affymetrix. Analiza statystyczna otrzymanych wyników została wykonana z wykorzystaniem Infrastruktury PL-Grid (//www.plgrid.pl).

Wyniki

Wyniki prezentujące profile stężeń mRNA w wycinkach endometrium o różnym stopniu zróżnicowania histopatologicznego gruczolakoraka wyznaczono metodą mikromacierzy ekspresyjnych, z zastosowaniem płytek HG-U133 A (Affymetrix). Ocenę zróżnicowania grup badanych

transkryptomów, rozpoczęto od normalizacji otrzymanych wyników za pomocą programu RMA Express (ryc. 2). 
W kolejnym etapie badań, przeprowadzono grupowanie hierarchiczne danych, umożliwiające wstępną ocenę podobieństwa profilu stężeń mRNA w badanych wycinkach endometrium (ryc. 3). 

Poszukując odpowiedzi na pytanie, które z obserwowanych różnic poziomu mRNA są statystycznie znamienne, przeprowadzono jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA, umożliwiającą porównanie kilku średnich bez przeprowadzania kilku testów t. Otrzymany wynik wskazuje, że w grupie 691 mRNA liczba mRNA różnicujących grupy wycinków gruczolakoraka endometrium zmienia się w zależności od siły różnicowania. Przy wartości p < 0,05 – p < 0,001 liczba mRNA wynosi od 203 mRNA do 45 mRNA (tab. 2A). 

Kontynuując analizę wariancji metodą wielokrotnych porównań – każdej średniej z każdą, z zastosowaniem testu post-hoc Tukey, uzyskano bardziej szczegółowe informacje dotyczące różnic stężenia mRNA pomiędzy poszczególnymi grupami transkryptomów (tab. 2B).

Otrzymany wynik wskazuje, że, liczba mRNA różnicujących G1 vs K = 27 mRNA, G2 vs K = 113 mRNA oraz G3 vs K = 81 mRNA przy założeniu, że wartość p < 0.05 (tab. 2B). Specyficzność mRNA w różnicowaniu poszczególnych grup pomiędzy sobą oceniono na podstawie diagramu Venna (ryc. 4). 

Uzyskane wyniki wskazują, że 6 mRNA zawsze różnicowało grupy wycinków tkanki tłuszczowej gruczolakoraka endometrium od kontroli, niezależnie od stopnia zróżnicowania histopatologicznego, podczas gdy liczba specyficznych mRNA dla różnicowania tylko G1 vs K = 15, G2 vs K = 43 oraz G3 vs K = 15 mRNA (ryc. 3).

Ten etap analizy zakończono testem nadreprezentatywności w programie PANTHER – Gene List Analysis, umożliwiającym wytypowanie pośród mRNA różnicujących te cząsteczki, które mają istotne znaczenie dla angiogenezy nowotworowej (tab. 3). Otrzymane wyniki wskazują, że dla gruczolakoraka endometrium w stopniu zróżnicowania G1 są to cząsteczki mRNA trzech genów: ENG (TGFBR3), EDIL3 oraz NRP2, charakteryzujące się istotnym wzrostem stężenia w odniesieniu do grupy porównawczej (tab. 3). 

Test nadreprezentatywności wskazuje brak mRNA różnicujących gruczolakoraka od kontroli, które byłyby charakterystyczne dla wszystkich stadiów zróżnicowania histopatologicznego (G1 vs K, G2 vs K oraz G3 vs K). Podobnie nie wykazano mRNA istotnych dla angiogenezy nowotworowej wspólnych dla G1 vs K i G2 vs K oraz G1 vs K i G3 vs K (tab. 3).

Omówienie wyników

Połączenie metod morfologicznych z dobrze poznaną biologią zmian przednowotworowych i inwazyjnych z technikami biologii molekularnej umożliwiającymi jednorazową ocenę ekspresji kilku tysięcy genów znacznie zwiększa precyzję diagnostyki i terapii oraz stanowi klucz do zastosowania terapii molekularnie ukierunkowanej (terapia celowana) u chorych na nowotwory. Możliwość użycia kryteriów molekularnych do doboru właściwej terapii dla danego pacjenta spowodowała gwałtowny rozwój medycyny personalizowanej, zwłaszcza w onkologii. Indywidualizacja leczenia polega na dostosowywaniu metod terapii do indywidualnych cech chorego i jego choroby.

W praktyce oznacza to wyodrębnianie podgrup pacjentów podobnych pod względem charakterystyki molekularnej zdefiniowanego biomarkera w ramach określonej jednostki chorobowej, a w konsekwencji na zastosowaniu u danej podgrupy chorych odpowiednio dobranej, skuteczniejszej i bezpieczniejszej terapii. Powoduje to, że techniki biologii molekularnej stają się coraz powszechniejszym narzędziem diagnostycznym w praktyce klinicznej, a bieżące wyniki analizy ekspresji genów, biorących udział w procesach przednowotworowych i kancerogenezie, dobrze korelują z opisanymi obrazami patomorfologicznymi. Zaletą diagnostyki molekularnej jest to, że umożliwia wykrywanie zmian nowotworowych u osób wysokiego ryzyka już w początkowym etapie choroby, ponieważ zmiany na poziomie molekularnym wyprzedzają zmiany na poziomie fenotypowym. Dodatkowo umożliwia wykrywanie lekooporności, zwiększając precyzję strategii leczenia. 

Otrzymane wyniki wskazują, że profil stężenia mRNA genów, uczestniczących w regulacji angiogenezy, zmienia się w zależności od stopnia zróżnicowania histopatologicznego gruczolakoraka. Najmniejsze różnice w odniesieniu do grupy referencyjnej obserwowano w gruczolakoraku w stopniu zróżnicowania histopatologicznego G1, podczas gdy transkryptomy gruczolakoraka endometrium w stopniu G2 i G3 stanowiły odrębną podgrupę (ryc. 2).

Podobne wnioski można wyciągnąć na podstawie statystyk opisowych charakteryzujących profil stężenia 691 mRNA związanych z regulacją angiogenezy w badanych grupach wycinków gruczolakoraka endometrium (ryc. 3).
Zwiększenie stężenia mRNA obserwowano również w gruczolakoraku endometrium w stopniu zróżnicowania histopatologicznego G2 dla mRNA genu SEMA3B – semaforyna 3B, a w stopniu zróżnicowania G3 dla mRNA SEMA 3F – inhibitorów angiogenezy, utrudniających proliferację i przeżycie komórek śródbłonka. Wszystkie pozostałe cząsteczki mRNA wytypowane w teście nadreprezentatywności jako znaczące dla angiogenezy nowotworowej występowały w gruczolakoraku w stopniu G2 i G3 w stężeniu znacznie mniejszym aniżeli w kontroli. Cechą charakterystyczną było to, że zmniejszenie poziomu mRNA stopniowo się zwiększało, wraz ze wzrostem stopnia zróżnicowania histopatologicznego gruczolakoraka endometrium (tab. 3F). Do tej grupy mRNA zaliczono jedną z izoform mRNA ENG (TGFBR3) powstającą w wyniku modyfikacji potranskrypcyjnej, mRNA TEK uczestniczący przy udziale angiopoetyny 1 za pomocą receptora Tie-2 w dojrzewaniu i stabilizacji naczyń krwionośnych oraz VEGF-C wspomagany przez czynniki modulujące jego aktywność.

Do czynników tych należy neuropilina 2 (NRP-2) pełniąca funkcję koreceptora niezbędnego w regulacji angiogenezy, również wytypowana w teście nadreprezentatywności jako mRNA znaczący dla angiogenezy nowotworowej. Ich ekspresja zachodzi głównie w komórkach śródbłonkowych naczyń krwionośnych i w niektórych komórkach nowotworowych. NRP-2 tworzy kompleks z VEGF-C i w połączeniu z receptorem KDR uczestniczy w regulacji angiogenezy, natomiast w połączeniu z receptorem VEGFR-3 w komórkach śródbłonka subpopulacji naczyń limfatycznych bierze udział w limfangiogenezie. Badania wykonane na myszach wykazały, że nadekspresja NRP powoduje anomalie w układzie naczyniowym serca, co dowodzi istotnej ich roli w rozwoju organizmu. Dodatkowo NRP-2 jest również niezbędnym składnikiem w wiązaniu semaforyny 3 (Sema 3A), która jest koniecznym warunkiem przekazywania sygnału w niektórych szlakach Sema 5 A. HOXA5 jest białkiem typu homeobox (Hox) uczestniczącym w modelowaniu aktywności transkrypcyjnej genów związanych z regulacją angiogenezy.

Przeprowadzona analiza ekspresji genów angiogenezy uczestniczących w powstawaniu fenotypu raka endometrium potwierdza fakt, że fenotyp guza nowotworowego jest wypadkową zachodzących w nim złożonych procesów molekularnych. Dotychczas stosowane techniki: analiza nothern-blotting, Q-PCR (Taq Man), Differential Display (porównywanie ekspresji losowo namnożonych fragmentów RNA), analiza dot-blot (macroarrays), SAGE (sekwencyjna analiza ekspresji genów), nie pozwalały na całkowitą ocenę stanu nowotworu i tym samym podejmowanie prób indywidualizacji leczenia. Taką nadzieję daje mikromacierz DNA, zwana również czujnikami DNA bądź chipami genowymi, zawierającymi uporządkowaną liczbę sond, dzięki którym możliwe jest badanie ekspresji od 5 do 30 tys. genów jednocześnie [18].

Pomimo molekularnej złożoności angiogenezy i limfangiogenezy potencjalne znaczenie badań tego zjawiska ma kliniczne uzasadnienie i wytycza zasadnicze kierunki badań w poznaniu czynników wpływających na proliferację guza nowotworowego, poszukiwaniu nowych czynników prognostycznych i markerów diagnostycznych.

Piśmiennictwo

1. Zemła B.F.P. Epidemiologia nowotworów złośliwych narządów płciowo-moczowych w populacji śląskich kobiet i mężczyzn. Zakład Epidemiologii Nowotworów Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie w Gliwicach (Regionalny Śląski Rejestr Nowotworów), Gliwice, 2002.
2. DiSaia P.J., Creasman W.T. Ginekologia onkologiczna. Wydawnicto Czelej, Lublin 1999.
3. Ribatti D. Judah Folkman, a pioneer in the study of angiogenesis. Angio 2008; 11: 3–10.
4. Michalski B., Michalski M. Angiogeneza. Czynniki wzrostu śródbłonka naczyniowego celem terapii antyangiogennej. w: Zarys ginekologii onkologicznej. Markowska J., Mądry R. (red.). Termedia Wydawnictwa Medyczne, Poznań 2012; 379–392.
5. Michalski B., Michalski M. Angiogeneza w nowotworach. Zarys ginekologii onkologicznej. Tom 1. Wyd. 2. uzup. Markowska J., Mądry R. (red.). Termedia Wydawnictwa Medyczne, Poznań 2015; 375–394.
6. Kasper D.L., Braunwald E., Fauci A.S. i wsp. Cancer cell biology and angiogenesis: w: Harrison’s Principles of Internal Medicine. Kasper D.L., Fauci A.S., Longo D.L. i wsp. (red.). Wyd. 16. McGraw-Hill Medical Publishing Division, New York 2005.
7. Carpini J.D., Karam A.K., Montgomery L. Vascular endothelial growth factor and its relationship to the prognosis and treatment of breast, ovarian, and cervical cancer. Angiogenesis 2010; 13: 43–58.
8. Döme B., Hendrix M.J.C., Paku S. i wsp. Alternative vascularization mechanisms in cancer pathology and therapeutic implications. Am J Pathol 2007; 170: 1–15.
9. Madej J. Rysunek naczyniowy zmian części pochwowej macicy i jego znaczenie w diagnostyce kolposkopowej. Przegl. Lek. 1971; 89: 524–528.
10. No J.H., Jo H., Kim S.H. i wsp. Expression of MMP-2, MMP-9, and urokinase-type plasminogen activator in cervical intraepithelial neoplasia. Ann N Y Acad Sci 2009; 1171: 100–104.
11. Li Ch.Y., Shan S., Huang Q. i wsp. Initial stages of tumor cell – induced angiogenesis: evaluation via skin window chembers in rodent models. J Natl Cancer Ins 2000; 92: 143–147.
12. Weber C.E., Kuo P.C. The tumor microenvironment. Surg Oncol 2012; 21: 172–177.
13. Korek E., Krauss H. Nowe adipokiny o potencjalnym znaczeniu w patogenezie otyłości i zaburzeń metabolicznych. Postępy Hig Med Dosw 2015; 69: 799–810.
14. Lauvrud A.T., Kelk P., Wiberg M. i wsp. Characterization of human adipose tissue-derived stem cells with enhanced angiogenic and adipogenic properties. Tissue Eng Regen Med 2017; 11: 2490–2502.
15. Barron G.A., Goua M., Wahle K.W. i wsp. Circulating levels of angiogenesis-related growth factors in breast cancer: A study to profile proteins responsible for tubule formation. Oncol Rep 2017; 38: 1886–1894.
16. Ghasemi A., Hashemy S.I., Aghaei M. i wsp. Leptin induces matrix metalloproteinase 7 expression to promote ovarian cancer cell invasion by activating ERK and JNK pathways. J Cell Biochem 2017; doi: 10.1002/jcb.26 396.
17. Tahergorabi Z., Khazei M. The relationship between inflammatory markers, angiogenesis, and obesity. ARYA Atheroscler 2013; 9: 247–253.
18. Butcher L.M., Meaburn E., Liu L. Genotyping pooled DANN on microarrays: a systematic genome screen of thousands of SNPs in large samples to detect QTLs for complex traits. Behavior Genet 2004; 34: 549–555.