Suplementacja czynników o potencjale metylacyjnym a epigenetyczna regulacja aktywności genów w programowaniu płodowym

Epigenetyka, czyli badanie wpływu czynników środowiskowych na rozwój i zdrowie człowieka zakłada, że proces dziedziczenia pewnych cech, w szczególności tych, które nie są determinowane sekwencją jądrowego DNA, odbywa się także pozagenowo, pozasekwencyjnie. Najbardziej istotnym mechanizmem epigenezy jest metylacja DNA, która polega na przyłączaniu grup metylowych (CH3) do jednego z nukleotydów, tj. cytozyny w tzw. wyspach cytozynowo-guaninowych (CpG) będących promotorami transkrypcji genów, co powoduje supresję w odczytywaniu tak zmienionego genu. Zmetylowany, chociaż nadal o prawidłowej sekwencji gen wciąż będzie się znajdował w jądrze komórkowym i w czasie podziałów mitotycznych będzie przekazywany komórkom potomnym, ale nie będzie funkcjonalny, więc efekt będzie taki, że komórka zostaje pozbawiona funkcji kodowanego przezeń białka. Inne mechanizmy epigenetyczne to modyfikacja poprzez metylację histonów, zasadowych białek tworzących chromatynę co prowadzi do wyciszenia transkrypcji genu; oraz interferencja RNA w procesie transkrypcji z matrycy DNA i translacji co powoduje kontrolowanie aktywności genu w zależności od zapotrzebowania na dane białko. W procesie gametogenezy przed zapłodnieniem i w trakcie ciąży, szczególnie w pierwszym trymestrze, kiedy odbywa się kluczowa dla rozwoju zarodka i płodu organogeneza istotne wydaje się tu osiągnięcie prawidłowego poziomu metylacji genów, tak by uzyskać korzystny potencjał genetyczny w przeciwdziałaniu rozwojowi wad rozwojowych u potomstwa i w dalszym życiu osobniczym takich schorzeń cywilizacyjnych jak: miażdżyca, choroby układu sercowo-naczyniowego, cukrzyca typu II, otyłość, nowotworzenie, depresja czy choroby neurodegeneracyjne [1].

Czynniki metylacyjne

Czynniki o potencjale metylacyjnym zawarte w diecie i suplementach diety to:

• S-adenozylometionina (pochodna metioniny),
• 5-metyltetrahydrofolian (aktywny biologicznie metabolit kwasu foliowego,)
• cholina.
   

Jednym z pierwszych poznanych czynników epigenetycznych jest kwas foliowy (witamina B9), którego niedobór we wczesnym okresie rozwoju zarodka może przyczyniać się do zaburzeń procesu neurulacji skutkujących wadami ośrodkowego układu w tym cewy nerwowej, jak również wad serca, układu moczowego, twarzoczaszki i kończyn. Niedobory kwasu foliowego należą do najczęściej spotykanych niedoborów witaminowych u ludzi. Kluczową rolą kwasu foliowego jest dostarczanie reszt jednowęglowych związkom, które biorą udział w podziałach komórkowych (tworzeniu kwasów nukleinowych), syntezie białek, metabolizmie aminokwasów (przemiana seryny i glicyny), katabolizmie histydyny do kwasu glutaminowego oraz przekształcaniu homocysteiny (Hcy) do metioniny. Niedostateczna metylacja kwasów nukleinowych, białek, a przede wszystkim hiperhomocysteinemia prowadzą do zaburzeń semikonserwatywnej replikacji DNA w czasie szybkiej proliferacji komórek tarczy zarodkowej i trofoblastu, a później w trakcie tworzenia się łożyska powodują uszkodzenie śródbłonków naczyń, m.in. poprzez gwałtownie postępujące zmiany aterogenne. Niski stopień metylacji lipidów prowadzi do ich utlenowania i tworzenia pochodnych kwasu hydroksyperoksytetraenowego (HPETE), które hamują syntezę korzystnego dla funkcjonowania naczyń krwionośnych czynnika jakim jest prostacyklina (PGI), co istotnie nasila procesy miażdżycowe. Wykazano, że zmniejszona podaż folianów i/lub obniżona aktywność enzymu reduktazy metyltetrahydrofolianowej (MTHFR), z uwagi na jej polimorfizmy, skutkuje zwiększeniem stężenia homocysteiny. Upowszechnienie Programów Redukcji Wad Cewy Nerwowej w krajach o niedostatecznej podaży folianów poprzez suplementację kwasu foliowego i fortyfikowanie nim żywności spowodowało zmniejszenie występowania WCN o 72% w grupach niskiego ryzyka i 68% w grupie kobiet o podwyższonym ryzyku, które urodziły już dziecko z tą wadą. Brak większej skuteczności suplementacji kwasem foliowym jest tłumaczony faktem występowania WCN niefolianozależnych, o etiologii innej niż deficyt podaży folianów. Kolejne badania wykazały, że zwiększony poziom Hcy w surowicy krwi obserwuje się również w przypadku deficytu koenzymów metabolizmu folianów, tj witaminy B2 (ryboflawiny), B6 (pirydoksyny) i B12 (kobalaminy). Homocysteina jest produktem wewnątrzkomórkowego metabolizmu aminokwasu metioniny z białek pokarmowych i uwalniana jest do osocza. Nie jest wykorzystywana ponownie do syntezy białka i w wysokich stężeniach działa szkodliwie na integralność śródbłonków naczyń. Organizm ludzki wytworzył ewolucyjnie dwa mechanizmy obronne przed hiperhomocyteinemią. Pierwszy to przekształcenie Hcy w procesie transsulfuracji do cysteiny. W tej reakcji witamina B6
działa jako koenzym β-syntazy cystationiny. Drugi mechanizm to ponowna remetylacja Hcy do metioniny. Witamina B12 działa tu jako koenzym syntazy metioniny. Witamina B2 jest z kolei niezbędna przy redukcji kwasu foliowego do jego aktywnej formy, tj. tetrahydrofolianu. Ryboflawina jest w tej reakcji donorem równoważników redukujących. Obszerny przegląd literatury przedmiotu wskazuje, że dla optymalnego metabolizmu szlaków reszt jednowęglowych w okresie organogenezy i placentogenezy, a przez to dla minimalizacji uszkodzeń DNA i prawidłowej angiogenezy i funkcji naczyń łożyska, suplementacja kwasu foliowego powinna być połączona z należną podażą witamin B6 i B12 [2]. Hiperhomocysteinemia jest czynnikiem ryzyka poronień, w tym poronień nawykowych, niewydolności łożyska i wewnątrzmacicznego opóźnienia (zahamowania) wzrastania płodu oraz wad cewy nerwowej. Co istotne, dla uzyskania optymalnego potencjału metylacyjnego wewnątrz komórki niezbędne jest utrzymanie prawidłowego stężenia S-adenozylometioniny (SAM). To właśnie ten związek dostarcza grup metylowych dla reakcji transmetylacji DNA i histonów. W przypadku niskiego poziomu SAM przewagę w komórce uzyskuje S-adenozylohomocysteina (SAH), której stężenie wzrasta proporcjonalnie do wzrostu stężenia homocysteiny co powoduje zahamowanie remetylacji Hcy do metioniny. Badania Fournessa i wsp. w 2013 r. wykazały, że suplementacja kwasu foliowego w II trymestrze ciąży wraz z witaminami B6 i B12 redukują stężenie Hcy w surowicy krwi, a kobiety z hiperhomocysteinemią i niskimi stężeniami folianów i witamin B6 i B12 rodziły dzieci z hipotrofią. Metaanaliza opublikowana w 2014 r. przez Wanga i wsp. pokazuje, że niedobory witaminy B12 zwiększają ryzyko WCN ponad 2-krotnie niezależnie od podaży kwasu foliowego [3]. Natomiast badanie przeprowadzone przez zespół Molloy’a w 2009 r. wykazało, że kobiety z niedoborem witaminy B12 miały 5-krotnie większe ryzyko urodzenia dziecka z WCN w porównaniu do kobiet z prawidłowym jej poziomem [4]. 
Jednym z istotnych wpływów epigenetycznych poza redukcją WCN jest zmniejszenie częstości porodów przedwczesnych u kobiet suplementujących czynniki o potencjale metylacyjnym. Badanie przeprowadzone na dużej grupie kobiet (ok. 36 tys.) Duńskiej Narodowej Kohorty Narodzin (DNBC, Danish National Birth Cohort) przyjmujących regularnie pre- i postkoncepcyjnie preparaty wielowitaminowe (zawierające kwas foliowy i witaminy z grupy B) odnotowano redukcję zaistnienia porodu przedwczesnego o 20% i urodzenie noworodków z niską masą urodzeniową (SGA, small for gestational age) przez kobiety z prawidłową masą ciała (BMI <25 kg/m²) [5].
W innym badaniu na równie dużej kohorcie badanych kobiet (ok. 34,5 tys.) przyjmujących kobiet kwas foliowy w okresie przedkoncepcyjnym stwierdzono redukcję częstości przedwczesnego zakończenia ciąży o 70% w okresie pomiędzy 20–28 tygodnia ciąży i o 50% w okresie pomiędzy 28–32 tygodniem [6]. 
Inne epigenetyczne efekty suplementacji kwasu foliowego to korzystny wpływ na rozwój behawioralny dzieci. Badania przeprowadzone na ogromnej populacji (ponad 85 tysięcy) dzieci w wieku 8–9 lat wykazały, że przyjmowanie kwasu foliowego minimum miesiąc przed koncepcją i podczas I trymestru ciąży było powiązane ze zmniejszeniem nadpobudliwości ruchowej (częstej w przypadku zespołu ADHD) oraz redukcją wystąpienia autyzmu o 39% w porównaniu do grupy kobiet, które nie stosowały dodatkowej podaży suplementu w krytycznym okresie organogenezy [7]. Kolejne badanie przeprowadzone z udziałem blisko 39 tysięcy dzieci w wieku 3 lat wykazało, że przyjmowanie przez matkę kwasu foliowego w okresie od 4 tygodni przed koncepcją do 8 tygodnia ciąży wiązało się z redukcją o 45% ryzyka wystąpienia zaburzeń mowy [8].
Składnikiem, który stanowi cenne źródło reszt metylowych jest również cholina. W przeciwieństwie do aktywnego folianu (MTHF), który transferuje 1 resztę metylenową, cholina transferuje je aż 3. Jako prekursor fosfatodylocholiny jest niezbędna w dużych ilościach do genezy błon komórkowych, mielinizacji aksonów komórek nerwowych, podziału komórek czy tez prawidłowego rozwoju łożyska. Jest także niezbędna do syntetyzowania acetylocholiny, jednego z głównych neurotransmiterów. Utlenowany w nerce metabolit choliny – betaina służy jako donor reszt metylowych biorących udział w metylacji DNA, która moduluje epigenom płodu. Metabolizm choliny jest ściśle powiązany z metabolizmem folianów, witamin z grupy B oraz metioniną. Brak choliny w diecie takich osób skutkuje stłuszczeniem wątroby, obumieraniem hepatocytów oraz uszkodzeniem mięśni. W przypadku kobiet w okresie ciąży, kiedy stężenie estrogenów jest wyższe, endogenna produkcja choliny jest zwiększona, pomimo to zapotrzebowanie na cholinę w ciąży się zwiększa. Amerykański Instytut Medycyny rekomenduje dzienne spożycie choliny przez kobiety ciężarne na poziomie 450 mg, niemniej badania wykazują, że aż 90% kobiet w wieku rozrodczym nie spożywa zalecanej porcji tego składnika. Obserwacyjne badanie potwierdziło, że niskie spożycie choliny w diecie Amerykanek (<150 mg/dzień) jest niezależnym od spożycia kwasu foliowego czynnikiem, który koreluje z podwyższonym ryzykiem wystąpienia WCN u potomstwa (4-krotny wzrost) i rozszczepu wargi/podniebienia (1,7-krotny wzrost) [9]. W badaniu, które wykazało związek spożycia choliny przez kobiety w ciąży z lepszym rozwojem intelektualnym ich dzieci w wieku 7 lat. Podczas ciąży cholina z obu źródeł (endogenna produkcja oraz z diety) jest aktywnie przenoszona do płodu, jej stężenie jest 14-krotnie większe w tkankach płodu w porównaniu do krwi matki. Dodatkowo cholina usprawnia także aktywny transport kwasu dokozaheksaenowego ważnego składnika mózgu oraz siatkówki oka przez łożysko do płodu [10]. Niedawno ukazało się kilka prac wykazujących korzystny wpływ choliny na funkcję nabłonka naczyń krwionośnych łożyska. Wysokie dawki choliny 930 mg/d przyjmowane przez kobiety w III trymestrze ciąży redukowały o 30% ilość kinazy (sFLT1) hamującej korzystne działanie czynnika wzrostu nabłonka naczyniowego (VEGF), co skutkowało poprawą przepływu krwi w łożysku. Cholina wspiera łączenie się VEGF ze związaną z błoną naczyń krwionośnych kinazą tyrozynową (mFTL1), która uszczelnia naczynia i usprawnia przepływ krwi w łożysku. Zaburzenia w ukrwieniu łożyska są jedną z głównych przyczyn ryzyka stanu przedrzucawkowego [11]. Cholina ma także modulujący wpływ na aktywność osi podwzgórze-przysadka-nadnercze (HPA) u rozwijającego się płodu. Podaż wysokich dawek choliny zredukowała aktywność przysadki u dzieci z grupy wysokiej podaży choliny co skutkowało 33-procentowym zmniejszeniem stężenia kortyzolu we krwi pępowinowej po urodzeniu [12]. Podwyższona aktywność HPA prowadzi do zwiększonego ryzyka chorób wywoływanych stresem, tj. cukrzycy typu 2 i nadciśnienia tętniczego. Epigenetyczne działanie choliny opiera się na kilku aspektach jej biologicznej aktywności. Jako aktywny donor reszt metylowych wpływa na metylację nici DNA, wpływa także na cykl folianów a przez to na wytwarzanie nukleotydów niezbędnych do budowy DNA. Prawidłowe, bezbłędne powielanie (tj. semikonserwatywna replikacja) DNA i niezaburzona translacja, tj. przepisywanie informacji genetycznej z DNA na mRNA jest niezbędnym czynnikiem prawidłowej organogenezy i placento genezy w ciąży. Cholina jest także głównym składnikiem wchodzącym w skład błon białkowo-lipidowych. Dlatego jej prawidłowa podaż zapewnia zarówno prawidłowe przewodnictwo pomiędzy neuronami jak i prawidłowy stan oksydacyjny. Zmiany błon komórkowych labilności mogą prowadzić do zwiększonej oksydacji kwasów tłuszczowych, a w przypadku mitochondriów do nadprodukcji wolnych rodników. 

Równowaga metylacyjna

Wśród naukowców obecnie toczy się dyskusja na temat suplementacji czynników o potencjale metylacyjnym w zakresie dawki i okresie ich stosowania. Ponieważ jak ustalono optymalna protekcja  przed wystąpieniem WCN występuje przy wysyceniu erytrolemmy krwi matki, która stanowi magazyn puli folianowej w ustroju, stężeniem  ≥ 906 nmol/l (400 ng/mL) folianów.  Bazując na tym standardzie  w 2015 r.  WHO przyjęła to za obowiązującą rekomendację a amerykańska FDA ustaliła maksymalną bezpieczną dawkę suplementacji kwasem foliowy na 1 mg dziennie zarówno z diety jak i suplementów. Większa dobowa dawka może prowadzić wg. badań epidemiologicznych do hipermetylacyjnych zmian epigenomu skutkujących zaburzeniami pod postacią zwiększonego ryzyka wystąpienia astmy oskrzelowej, atopowej skóry, reakcji anafilaktycznych u potomstwa czy promocji nowotworów m.in. jelita grubego. Wnioski dotyczące wyników epidemiologicznych kohortowych badań w tym zakresie są ostatnio kontestowane przez wielu ekspertów w dziedzinie medycyny prewencyjnej, którzy jak sir Nicholas J. Wald przedstawiają swoje tezy oparte o na dowodach naukowych:

• Nie ma powodu ograniczać spożycia kwasu foliowego.
• Błędem jest rozdzielanie spożycia kwasu foliowego na kategorie bezpieczne i niebezpieczne. Wszystkie dawki stosowane w praktyce medycznej okazały się bezpieczne. Oznacza to zniesienie górnego limitu 1 mg, co nie powinno już budzić niepokoju. Dawka 4 mg powinna być dostępna w sprzedaży bez recepty (OTC).
• Celem wzbogacania powinno być dodanie wystarczającej ilości kwasu foliowego, aby osiągnąć pełny możliwy do osiągnięcia efekt.
• Do rządów należy nakazanie fortyfikacji jako uzasadnionego środka w zakresie zdrowia publicznego.
• W każdej ocenie ryzyka należy zbadać wszystkie dowody, ale jeśli dostępne są dowody ludzkie, tak jak w przypadku kwasu foliowego, powinny one mieć pierwszeństwo przed innymi dowodami (np. zwierzęcymi lub toksykologicznymi), a spekulacje nie powinny być akceptowane jako dowód. W ocenie należy uwzględnić, że wstrzymanie świadczenia stanowi szkodę oraz że konsekwencje ciąży z wadą wrodzoną, której można zapobiec, urodzenia martwego dziecka lub urodzenia dziecka z rozszczepem kręgosłupa, są kosztowne zarówno pod względem ludzkim, jak i finansowym [13].

Piśmiennictwo

1. Zeisel SH. Importance of methyl donors during reproduction. Am J Clin Nutr 2009;89:673-677.
2. Furness D, Fenech M, Dekker G et al . Folate, vitamin B12, vitamin B6 and homocysteine: impact on pregnancy outcome.  Matern Child Nutr. 2013; 9(2): 155-166.
3. Wang ZP, Shang X-X, Zhao Z-T. Low maternal vitamin B(12) is a risk factor for neural tube defects: a meta-analysis. J Matern Fetal Neonatal Med. 2012 ;25(4):389-94.
4. Molloy AM, Kirke PN, Troendle JF et al. Maternal vitamin B12 status and risk of neural tube defects in a population with high neural tube defect prevalence and no folic acid fortification. Pediatrics 2009;123:917-23.
5. Catov JM, Bodnar LM, Olsen J  et al. Periconceptional multiwitamin use and risk of preterm or small-for-gestational -age births in the Danish National Birth Cohosrt. Am J Clin Nutr 2011;94:906–12.
6. Bukowski R Malone FD, Porter FT et al. Preconceptional folate supplementation and risk of spontaneous preterm birth: a cohort study. PLoS Med. 2009;  6(5): e1000061. doi:10.1371/journal.pmed.1000061
7. Suren P, Roth C, Bresnahan M et al. Association between maternal use of folic acid supplements and risk of autism spectrum disorders in children. JAMA 2013;309:570-575.
8. Roth C, Magnus P, Schjolberg S et al. Folic acid supplements in pregnancy and severe language delay in children. JAMA 2011;306:1566-73.
9. Shaw GM, Carmichel SL, Wei Yang et al. Periconceptional dietary intake of choline and betaine and neural tube defects in offspring. Am J Epidemiol 2002; 160:102-109.
10. Zeisel SH. Nutrition in pregnancy: the argument for including a source of choline. International Journal of Women’s Health 2013;5:193-99.
11. Jiang X et al. Maternal choline supplementation: a nutritional approach for improving offspring health? Trends in Endocrinology and Metabolism 2014;25(5):263-73.
12. Jiang, X. et al. Maternal choline intake alters the epigenetic state of fetal cortisol-regulating genes in humans FASEB J. 2012; 26, 3563– 3574.
13. Wald NJ. Folic acid and neural tube defects: discovery, debate and the need for policy change. J Med Screen 202229:138-146.